檸檬桉樹脂中多酚的提取純化及抗氧化活性

(1.桂林理工大學(xué)南寧分校， 廣西南寧530001；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西南寧530004)

檸檬桉(Eucalyptuscitriodira)，又名油桉樹，為桉樹大家族中的佼佼者，其主要用途為制漿造紙和人造板的原材料[1-2]。對(duì)于桉樹化學(xué)成分的利用，目前已有報(bào)道的主要為各種桉樹樹干、枝葉的揮發(fā)油，以及桉樹果實(shí)中多酚、皂苷等成分的提取分離及抗菌活性研究[3-5]。

在植物成分的提取方面，目前應(yīng)用較多的方法有溶劑提取法[6]、超聲波提取法[7]、臨界萃取法[8]等。在粗提物的純化方面，現(xiàn)階段常用的純化方法多為大孔樹脂吸附法、液—液萃取法[9]、金屬試劑絡(luò)合沉淀法[10]等。對(duì)于檸檬桉樹脂的活性研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已有報(bào)道的主要為其驅(qū)蟲活性及抗腫瘤性能[11-12]。而對(duì)于檸檬桉樹脂中多酚的提取純化及抗氧化活性研究還鮮見報(bào)道，為提高檸檬桉樹的綜合利用率，本文選擇檸檬桉樹樹脂作為研究對(duì)象，對(duì)其具有抗氧化活性的多酚成分進(jìn)行提取和進(jìn)一步純化，為檸檬桉樹邊角料的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

檸檬桉樹脂采摘于廣西大學(xué)校園內(nèi)。

將檸檬桉樹脂固體挑選干凈，研磨得到粉末狀樹脂。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要實(shí)驗(yàn)試劑：無水乙醇、98 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃硫酸、茴香醛、六水合三氯化鐵、碳酸鈉、冰醋酸、亞硝酸鈉、明膠、磷酸鈉、30 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、福林酚、無水碳酸鈉、鉬酸銨、乙酸乙酯、正丁醇、沒食子酸、抗壞血酸(VC)等，以上試劑均為分析純，生產(chǎn)廠家為廣東光華科技股份有限公司；二苯代苦味肼基，分析純，生產(chǎn)廠家為日本W(wǎng)ako公司；蘆丁，分析純，生產(chǎn)廠家為上海柏卡化學(xué)技術(shù)有限公司。

主要儀器：UV2550型紫外可見分光光度計(jì)，生產(chǎn)廠家為日本島津儀器公司；RE2000E-2L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，生產(chǎn)廠家為河南佰澤儀器有限公司；GE-16A型高速離心機(jī)，生產(chǎn)廠家為上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檸檬桉樹脂多酚的提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g檸檬桉樹脂粉末，加入一定量的無水乙醇溶液，經(jīng)常壓過濾后，真空濃縮干燥其濾液，即可得到檸檬桉樹脂多酚的粗提物，用60 %乙醇溶液溶解粗提物，得到檸檬桉樹脂的多酚粗提液[13]。

1.3.2 檸檬桉樹脂多酚的定性分析

分別加入1 %的明膠溶液、2 %三氯化鐵溶液以及NaNO2—CH3COOH溶液到檸檬桉樹脂多酚粗提液中，同步用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參照物，搖勻后觀察各個(gè)試管中溶液顏色的變化[14]。

1.3.3 檸檬桉樹脂多酚的定量分析

① 工作曲線的繪制

準(zhǔn)確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL濃度為0.2 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個(gè)容積為50 mL的棕色容量瓶中，然后在各棕色瓶中依次加入2.0 mL福林酚溶液，4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的 Na2CO3溶液，最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 %乙醇溶液定容，搖勻后靜置40 min。同步用60 %的乙醇溶液作對(duì)照。采用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)650～800 nm范圍內(nèi)確定最大吸收波長(zhǎng)，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

② 多酚溶液中的含量測(cè)定

量取一定體積檸檬桉樹脂的多酚提取液，參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法，顯色后在最大吸收波長(zhǎng)下平行測(cè)3次吸光度，計(jì)算多酚的平均含量。

③ 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取5份一定體積濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色容量瓶中，用福林酚法[15]顯色后，在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算其RSD值。

④ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1份一定體積的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用福林酚法[15]顯色后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，每隔10 min測(cè)一組，每組平行測(cè)3次，取平均值，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

⑤ 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取5份體積為0.25 mL的粗提液，各加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)福林酚法[15]顯色后，在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算其加標(biāo)回收率。

1.3.4 粗提液的純化方法

① 乙酸乙酯萃取提純法

量取一定體積的多酚粗提液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其減壓蒸餾、干燥，加入蒸餾水使其濃縮物溶解，用等體積的乙酸乙酯溶液連續(xù)萃取3次，棄去下層液，收集上層萃取相。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)其減壓、濃縮，將其轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60 %的乙醇溶液中溶解，即可得到純化液[16]。

② 醇提水沉—正丁醇萃取提純法

用100 mL無水乙醇將5.0 g粗提物進(jìn)行溶解，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)溶液減壓、濃縮、干燥，再用蒸餾水溶解其干燥物，靜置至溶液分層，取底層樹脂重復(fù)2次上述操作，得到醇提水沉的底層樹脂，干燥后得到固體物質(zhì)。將此固體研磨呈粉末狀，再用100 mL蒸餾水將粉末溶解，用等體積的正丁醇溶液萃取3次，最后將正丁醇萃取相減壓、濃縮，即可得到多酚純化物[17]。

1.3.5 抗氧化性活性實(shí)驗(yàn)

① DPPH·清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]測(cè)定檸檬桉樹脂的多酚粗提物及各純化物對(duì)DPPH·的清除作用，以蒸餾水作為空白，于517 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度。每個(gè)濃度測(cè)定3次，取平均值。以蘆丁和VC作為對(duì)照物，根據(jù)式(1)計(jì)算各物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除率η。

(1)

其中：X0、X1、X2分別為DPPH·、樣品對(duì)DPPH·作用后及樣品自身的吸光度。

② 總抗氧化活性的測(cè)定

于具塞試管中，分別加入一系列不同濃度的檸檬桉樹脂多酚粗提液及各純化物2 mL，采用磷鉬試劑法對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)多酚的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。將蒸餾水作為參比溶液，沒食子酸作為對(duì)照物，計(jì)算總抗氧化能力(TA)[19-20]。

(2)

其中：X1為樣品吸光度，X2為對(duì)照樣品的吸光度；V2為反應(yīng)液總體積；V1為取樣量；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，滴加了明膠溶液的多酚粗提液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液均有沉淀物質(zhì)產(chǎn)生；滴加了三氯化鐵的兩種溶液均變成了藍(lán)色；滴加了NaNO2—CH3COOH溶液的兩種溶液均變成了黃色。即加入相同的定性溶液后，檸檬桉樹脂的粗提液與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的變化一致，表明檸檬桉樹脂中含有多酚物質(zhì)[21]。

2.2 定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得到如圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程為Y=145.32X+0.15，r2=0.999 7。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可見，精密度實(shí)驗(yàn)的RSD為0.61 %(小于5 %)，說明該方法的精密度較好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可見，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.92 %(小于5 %)，表明穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品在50 min之內(nèi)的顯色穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of stability test

2.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該實(shí)驗(yàn)的回收率均值為100.4 %，說明此方法有較好的準(zhǔn)確度，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test

2.3 多酚的提取及純化實(shí)驗(yàn)

檸檬桉樹脂粗提物中多酚含量為13.37 %,經(jīng)過乙酸乙酯溶劑進(jìn)一步萃取提純后，純化物中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.31 %，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為粗提物的2.12倍；經(jīng)過醇提水沉—正丁醇溶劑進(jìn)一步萃取提純后，純化物中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.65 %，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為粗提物的2.97倍。結(jié)果表明提純處理后樣品中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較粗提物都有一定的提高。

2.4 檸檬桉樹脂多酚抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除作用測(cè)定

以VC為參照，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多酚粗提物及純化物對(duì)DPPH·的自由基清除效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可見，在濃度為0.01～0.14 mg/mL時(shí)，各樣品濃度與DPPH·的清除能力呈量效關(guān)系；在濃度為0.01～0.10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的清除能力總體上隨著各樣品濃度的增大而增強(qiáng)；當(dāng)濃度達(dá)到0.1 mg/mL后，醇提水沉—正丁醇純化物的抗氧化性接近VC并趨于平緩，粗提物與乙酸乙酯純化物的抗氧化性相差不大。

2.4.2 總抗氧化活性的測(cè)定

以VC為參照，考察各多酚提取物的總抗氧化活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，總抗氧化活性隨著各樣品中多酚濃度的增加而增加。當(dāng)樣品中濃度大于0.04 mg/mL時(shí)，粗提物及各純化物的總抗氧化活性明顯增強(qiáng)，VC的總抗氧化能力最強(qiáng)，其次為粗提物，再次為醇提水沉—正丁醇提純物，最后為乙酸乙酯純化物，詳見圖3。

圖2 不同濃度試樣對(duì)DPPH·的自由基清除效果
Fig.2 DPPH scavenging curve ofsamples with different concentration

圖3 各樣品的總抗氧化能力
Fig.3 Total antioxidant capacityof each sample

3 結(jié)論

① 用乙醇作為溶劑，對(duì)檸檬桉樹脂中的多酚進(jìn)行提取，可得粗提物中多酚含量為13.37 %；乙酸乙酯純化后多酚含量為28.31 %，醇提水沉—正丁醇純化后多酚含量為39.65 %，純化實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)進(jìn)一步提純后，多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定程度的提高。

② 定性實(shí)驗(yàn)表明，在樣品中加入相應(yīng)的顯色物質(zhì)后，檸檬桉樹脂中的多酚粗提液與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的變化一致，說明粗提物中存在多酚類物質(zhì)。

③ 定量實(shí)驗(yàn)分析中，精密度RSD為0.61 %，小于5 %，說明方法的精密度良好；穩(wěn)定性RSD為0.92 %，小于5 %，證明樣品在50 min之內(nèi)的穩(wěn)定性較好；加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，平均加標(biāo)回收率為100.4 %，證明此方法有較好的準(zhǔn)確度。

④ 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,抗氧化能力大小順序?yàn)閂C的總抗氧化能力最強(qiáng)，其次為粗提物，再次為醇提水沉—正丁醇提純物，然后為乙酸乙酯純化物，沒食子酸的總抗氧化能力最弱。各提純物的活性表現(xiàn)為多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其抗氧化能力越大；多酚粗提物的抗氧化能力較提純物更強(qiáng)，表明多酚粗提物中可能含有其他更強(qiáng)抗氧化能力的化學(xué)成分。