超聲萃取-高效液相色譜分析法測(cè)定土壤中2-氯-6-(三氯甲基)吡啶

蘇紅鴿, 張忠慶, 劉金華, 李 亓, 李佳昊, 周蒙蒙, 楊靖民

( 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 吉林省商品糧基地土壤資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 資源與環(huán)境學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118)

2-氯-6-(三氯甲基)吡啶(nitrapyrin, CP)是一種白色晶狀固體物質(zhì).Goring[1]報(bào)道了CP具有硝化抑制特性, CP施用到土壤后可顯著抑制硝化細(xì)菌的活性[2], 延緩銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化[3-4], 減少氮素的淋溶和溫室氣體排放[5-7], 從而提高了氮素利用率, 增加了作物產(chǎn)量[8-9].由于使用CP后, 易被土壤吸附而降低其有效性[10-13], 土壤對(duì)CP的吸附作用是影響其在土壤環(huán)境中有效性的重要因素, 因此建立可同時(shí)測(cè)定不同類(lèi)型土壤中CP含量的方法具有重要意義.

高效液相色譜法常用于土壤中有機(jī)物的定量分析, 該方法成熟、準(zhǔn)確度較高[14-16].張玉敏等[17]研究了甲基吡啶的高效液相色譜分析方法； 王岙等[18]通過(guò)液相色譜法同時(shí)測(cè)定兩種農(nóng)藥, 解決了用氣相色譜法和質(zhì)譜法存在保存期短、處理步驟繁瑣及二者分離較難的問(wèn)題.目前多采用高效液相色譜法分析吡啶類(lèi)物質(zhì)[19-24], 利用反相色譜柱和極性流動(dòng)相, 根據(jù)不同吡啶類(lèi)物質(zhì)在反相柱的吸附力不同進(jìn)行分離, 不需要高溫氣化, 測(cè)定更易實(shí)現(xiàn).土壤中有機(jī)物的提取方法主要包括索氏提取、超聲萃取和壓力萃取等, 其中索氏提取法提取率較高, 但存在耗時(shí)(>16 h)、有機(jī)溶劑消耗量大及操作復(fù)雜等缺點(diǎn)； 壓力萃取需配備專(zhuān)用儀器, 成本較高； 超聲波提取操作簡(jiǎn)單、節(jié)能且省時(shí)省力[18,25].超聲萃取-高效液相色譜分析法操作簡(jiǎn)單, 成本較低, 由于CP化合物的極性為中性, 沸點(diǎn)較低, 其在土壤中的提取和含量測(cè)試方法目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.因此本文用超聲萃取-高效液相色譜法測(cè)定土壤中的CP, 用Agilent SB-C18色譜柱, 優(yōu)化流動(dòng)相最佳體積比和最佳流速, 測(cè)定不同土壤類(lèi)型中CP的質(zhì)量濃度.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(安捷倫1260型, 美國(guó)安捷倫公司)： 六通閥進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和色譜柱(Agilent SB-C18不銹鋼柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm))； 高速冷凍離心機(jī)(Z36HK型, 德國(guó)HERMLE公司)； 恒溫水浴振蕩器(SHA-C型, 常州華普達(dá)儀器有限公司).CP乳油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%, 實(shí)驗(yàn)室制備)； CP微囊懸浮劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%, 實(shí)驗(yàn)室制備)； 甲醇、乙醇和乙腈(色譜純, 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； CP原藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%, 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)； CP標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%, 德國(guó)LGC Labort G-mbH·Bgm公司); 實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水.

1.2 供試土壤

選擇草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土3種供試土壤.在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站采集草甸黑土； 在吉林省農(nóng)安縣農(nóng)田采集黑鈣土； 在吉林省梨樹(shù)縣農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站采集風(fēng)沙土.樣品采集地點(diǎn)均為連續(xù)多年種植玉米的土地, 且無(wú)硝化抑制劑CP的使用記錄, 土壤采樣深度為0～20 cm, 自然風(fēng)干, 剔除動(dòng)植物殘?bào)w, 過(guò)2 mm篩, 于密封袋中保存?zhèn)溆?3種供試土壤的基本性質(zhì)列于表1.

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.3 方 法

1.3.1 流動(dòng)相條件 參考文獻(xiàn)[19]用高效液相色譜法測(cè)定氯化產(chǎn)物及產(chǎn)品中CP的質(zhì)量比.將流動(dòng)相設(shè)為：V(甲醇)∶V(水)=9，V(甲醇)∶V(水)=4，V(甲醇)∶V(水)=7∶3；V(乙腈)∶V(水)=9，V(乙腈)∶V(水)=4，V(乙腈)∶V(水)=7∶3.測(cè)定CP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)的色譜圖.

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 用紫外檢測(cè)器在190～400 nm內(nèi)對(duì)CP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)進(jìn)行紫外區(qū)光譜掃描.

1.3.3 流動(dòng)相流速 參考文獻(xiàn)[19]， 用高效液相色譜法測(cè)定氯化產(chǎn)物及產(chǎn)品中CP的質(zhì)量濃度.考慮土壤浸提液中雜質(zhì)與CP的分離效果, 將流動(dòng)相流速分別設(shè)為0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mL/min, 考察不同流速對(duì)CP色譜峰峰型和保留時(shí)間的影響.

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作 用分析純乙醇和CP標(biāo)準(zhǔn)品分別配制0,2,5,10,20,25,45,75 mg/L的CP溶液, 以CP質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.4 測(cè)定方法評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 檢出限 對(duì)空白土壤樣品連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定20次, 根據(jù)峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差, 按

D=3q/S

(1)

計(jì)算檢出限.其中:D為檢出限;q為標(biāo)準(zhǔn)偏差;S為方法的靈敏度, 即回歸線(xiàn)方程的斜率.

1.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

1) 在最佳測(cè)定條件下, 對(duì)CP標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次, 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù).

2) 在3種土壤(CP無(wú)檢出)中分別添加低質(zhì)量濃度(25 mg/L)和高質(zhì)量濃度(75 mg/L)的CP標(biāo)準(zhǔn)溶液,m(固)∶V(液)=5, 重復(fù)3次, 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 取1.50 g于碘量瓶中, 先分別用15,15,5 mL分析純乙醇各超聲10 min提取土壤中的CP, 再于10 000 r/min離心, 上清液用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾, 低溫(-20 ℃)保存?zhèn)溆?在最佳測(cè)定條件下測(cè)定不同類(lèi)型土壤中CP的質(zhì)量比, 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù).

3) 選擇CP乳油和CP微囊懸浮劑兩種劑型, 分別稱(chēng)取土壤10.00 g, 在土壤中分別添加2 mL質(zhì)量濃度為50 mg/L不同劑型的CP水溶液, 充分混勻, 重復(fù)3次, 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 取1.50 g于碘量瓶中, 先分別用15,15,5 mL分析純乙醇各超聲10 min提取土壤中的CP, 再于10 000 r/min離心, 上清液用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾, 低溫(-20 ℃)保存?zhèn)溆? 在最佳測(cè)定條件下測(cè)定不同劑型中CP的質(zhì)量比, 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù).

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù), 用單因素方差分析法分析差異顯著性(Duncan新復(fù)極差法,p<0.05), 用Oringe 8.5軟件繪制圖表, 通過(guò)色譜工作站(ChemStation Edition for LC and LC/MS systems, C0.01.05[35])處理數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化CP測(cè)定條件

圖1 CP的紫外吸收曲線(xiàn)Fig.1 UV absorption curve of CP

當(dāng)用色譜法分析吡啶類(lèi)物質(zhì)時(shí), 選用C18色譜柱較多[19,21,26].由于高效液相色譜法測(cè)定吡啶類(lèi)物質(zhì)時(shí)的色譜柱類(lèi)型、流動(dòng)相、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)等均顯著影響樣品的測(cè)定準(zhǔn)確度, 因此本文研究不同流動(dòng)相及不同比例、流動(dòng)速度和檢測(cè)波長(zhǎng)等因素對(duì)CP質(zhì)量比測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度和檢測(cè)限的影響, 并用超聲萃取法測(cè)定不同類(lèi)型土壤中的CP質(zhì)量比.

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 當(dāng)溫度為25 ℃,V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min時(shí), CP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)的紫外光譜如圖1所示.由圖1可見(jiàn), 在λ=285 nm處有強(qiáng)吸收峰, 為芳香環(huán)體系特征吸收峰, 因此在該波長(zhǎng)處的檢測(cè)靈敏度較高, 可作為CP的檢測(cè)波長(zhǎng).

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 當(dāng)溫度為25 ℃, 流動(dòng)相流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm時(shí), 不同流動(dòng)相中CP的高效液相色譜如圖2所示.由圖2可見(jiàn): 乙腈明顯優(yōu)于甲醇作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果; 當(dāng)V(乙腈)∶V(水)=4, 保留時(shí)間為4.6 min時(shí)分離效果較好, 可將乙醇、CP及其他雜質(zhì)的色譜峰分開(kāi)且峰形規(guī)則, 因此選擇V(乙腈)∶V(水)=4為最優(yōu)流動(dòng)相.由于不同物質(zhì)的理化性質(zhì)不同, 因此對(duì)流動(dòng)相的選擇也不同[21-22,25].本文選擇的最佳流動(dòng)相可將CP與其他物質(zhì)完全分離.

圖2 不同流動(dòng)相的CP色譜Fig.2 Chromatograms of CP in different mobile phases

圖3 同一流動(dòng)相不同流速的CP色譜Fig.3 Chromatograms of CP of same mobile phase at different flow rates

2.1.3 流速的選擇 當(dāng)溫度為25 ℃,V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速分別為0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mL/min時(shí), CP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)的色譜如圖3所示.由圖3可見(jiàn): 當(dāng)流動(dòng)相流速較低(0.4,0.6 mL/min)時(shí), 樣品保留時(shí)間長(zhǎng), 分離效果好, 但測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)； 當(dāng)流速較高(1.2,1.4 mL/min)時(shí), 樣品保留時(shí)間短, 但分離效果差, 圖譜存在拖尾現(xiàn)象； 當(dāng)流速為0.8 mL/min, CP保留時(shí)間為4.55 min時(shí), 峰形及分離效果較好, 因此選其為最佳流速.

2.2 CP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖4 CP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curve of CP

在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm條件下, 測(cè)定質(zhì)量濃度分別為0,2,5,10,20,25,45,75 mg/L的CP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜, 以色譜峰面積為縱坐標(biāo)y, 進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4所示.由圖4可見(jiàn), CP的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈較好的線(xiàn)性關(guān)系(R2=0.999 8,p<0.01).

2.3 檢出限

在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm條件下, 對(duì)空白土壤樣品連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定20次, 根據(jù)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差, 按式(1)計(jì)算得到檢出限為0.42 mg/L, 表明該方法可準(zhǔn)確分析土壤中較低質(zhì)量濃度的CP.

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

2.4.1 CP準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm條件下, 對(duì)CP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L)重復(fù)進(jìn)樣10次, 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù), 結(jié)果列于表2.由表2可見(jiàn), 測(cè)定結(jié)果具有較好的重復(fù)性, 標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別為1.89和0.048, 即該方法測(cè)定CP標(biāo)準(zhǔn)溶液具有較高的準(zhǔn)確度和精密度.

表2 CP準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定

2.4.2 不同土壤中CP準(zhǔn)確度和精確度測(cè)定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm條件下, 在3種土壤中測(cè)定低質(zhì)量濃度(25 mg/L)和高質(zhì)量濃度(75 mg/L)CP的加標(biāo)回收率, 結(jié)果列于表3.由表3可見(jiàn), 該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度, 可用于草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土中CP質(zhì)量比的測(cè)定.

表3 土壤中CP準(zhǔn)確度和精確度測(cè)定

2.4.3 不同劑型CP在土壤中的準(zhǔn)確度和精確度測(cè)定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液為流動(dòng)相, 流速為0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm條件下, 不同劑型CP在土壤中質(zhì)量比測(cè)定結(jié)果列于表4.由表4可見(jiàn)： CP乳油在草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土中的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.14,2.68,3.06, 變異系數(shù)分別為0.03,0.03,0.04； CP微囊懸浮劑在草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土中的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.05,3.03,1.34, 變異系數(shù)分別為0.04,0.04,0.02.表明該方法可用于不同劑型CP在不同土壤中含量的測(cè)定, 具有較高的準(zhǔn)確度和精密度.

綜上所述, 本文給出了超聲萃取-高效液相色譜法測(cè)定不同類(lèi)型土壤中硝化抑制劑CP含量的方法.以乙腈和蒸餾水為流動(dòng)相, 最佳比例為V(乙腈)∶V(水)=4, 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm, 最佳流速為0.8 mL/min, 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性顯著(R2=0.999 8,p<0.01), 檢出限為0.42 mg/L.在最佳條件下, 用超聲萃取-高效液相色譜法可在4.5 min內(nèi)分離測(cè)定草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土中CP的含量, 不同質(zhì)量濃度和不同劑型CP溶液在草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土中添加24 h的回收率為82.44%～91.66%, 標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34～5.04, 變異系數(shù)為0.02～0.06.該方法快速簡(jiǎn)便、精密度和準(zhǔn)確度較高, 可用于不同類(lèi)型土壤中不同劑型硝化抑制劑CP含量的測(cè)定.

表4 不同劑型CP在土壤中準(zhǔn)確度和精確度測(cè)定