斑馬魚(yú)miR-196a-1基因敲除品系的構(gòu)建

曾 婷，付貴芳，謝繽靈，杜 涵，謝華平,3*，印遇龍,3,4

(1.動(dòng)物腸道功能調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410081； 2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與人體健康實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410081； 3.淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410081； 4.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410125)

斑馬魚(yú)(Daniorerio)，俗稱(chēng)“zebrafish”，屬硬骨魚(yú)類(lèi)，原產(chǎn)印度和孟加拉，為一種性情溫和、雜食性的熱帶淡水魚(yú)[1,2]。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)成本低、繁殖力強(qiáng)、易大規(guī)模飼養(yǎng)，3個(gè)月可性成熟、胚胎易得、便于觀察，且斑馬魚(yú)和人類(lèi)基因有高達(dá)87%的同源性，這些優(yōu)點(diǎn)使斑馬魚(yú)成為研究人體疾病和發(fā)育機(jī)理的理想模式生物[3,4]。

miRNA是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度為19～23個(gè)堿基的非編碼RNA。一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因[5]，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)[6]。miRNA存在多種形式，其被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為有帽子結(jié)構(gòu)的和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)，該轉(zhuǎn)錄本可以是蛋白質(zhì)編碼的，也可以是非蛋白質(zhì)編碼的。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物在核糖核酸酶Drosha和輔助因子Pasha的共同作用下切割產(chǎn)生約70個(gè)堿基的莖環(huán)前體miRNA(pre-miRNA)，再被細(xì)胞質(zhì)核糖核酸酶Dicer切割生成成熟的miRNA和反義miRNA(miRNA*)[7]。成熟的miRNA被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，該復(fù)合物通過(guò)與miRNA的堿基配對(duì)識(shí)別靶mRNA，最常見(jiàn)的是抑制靶mRNA的翻譯或使其翻譯不穩(wěn)定[8]。

miRNA最初被發(fā)現(xiàn)是在線蟲(chóng)中參與lin-4的發(fā)育，而在哺乳動(dòng)物中miRNA參與造血譜系分化和同源框基因調(diào)控[9,10]。隨后Muy等[11]研究發(fā)現(xiàn)microRNA表達(dá)水平的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Zhang等[12]的報(bào)道表明miR-196a在宮頸癌細(xì)胞中靶向調(diào)控netrin4基因，通過(guò)靶向同源基因團(tuán)來(lái)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的發(fā)育[13,14];miR-196a在胃癌的預(yù)后過(guò)程中表達(dá)上升[15]；還有研究表明，miR-196a在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)，在食管鱗癌患者唾液中miR-196a的表達(dá)比正常人高27倍，因此，miR-196a可能作為潛在的食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)志[16]。在非洲爪蟾中，miR-196a的劑量不同會(huì)導(dǎo)致特定的眼部發(fā)育異常[17]。通過(guò)生物信息學(xué)分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)miR-196a-1基因在各個(gè)物種中十分保守，說(shuō)明miR-196a-1基因在調(diào)控生物體的發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來(lái)火熱的基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由兩部分組成，CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列和Cas9蛋白。CRISPR結(jié)構(gòu)骨架序列由前導(dǎo)序列、Cas基因、CRISPR基因座共同組成，具有招募Cas蛋白作用[18]。Cas9蛋白具有能特異性切割DNA雙鏈的作用。CRISPR基因座經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄加工后，得到小片段的CRISPR RNA即crRNA，而crRNA與反式激活的crRNA即tracrRNA能形成一種嵌合RNA，該嵌合RNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物，從而切斷基因組DNA[19,20]。后來(lái)科學(xué)家進(jìn)一步改造，將crRNA和tracrRNA改造成一個(gè)向?qū)NA(sequence-specific guide RNA，sgRNA)[21]。目的基因靶位置序列的3’端有原間隔序列相鄰基序PAM(protospacer adjacent motifs),為5’-NGG-3’序列，這是Cas9蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。最后，通過(guò)改變sgRNA序列，體外合成sgRNA，Cas9蛋白可以靶向切割目的基因，從而達(dá)到基因敲除的目的[22,23]。

目前，miRNA調(diào)控生物發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展機(jī)制越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但是，許多miRNA的功能仍然未知。為了研究miR-196a-1基因在斑馬魚(yú)腸道發(fā)育過(guò)程中的作用，本文利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú)miR-196a-1基因敲除品系，為探究miR-196a-1在腸道發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本文用于試驗(yàn)的TU品系斑馬魚(yú)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖。水溫28 ℃，pH值在6.5～7.5，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)。1對(duì)斑馬魚(yú)1周產(chǎn)1次卵，1次產(chǎn)卵約200個(gè)胚胎，胚胎在恒溫28.5 ℃的E3水中培養(yǎng)，胚胎2 d后破膜，第5天開(kāi)始喂食草履蟲(chóng)至2周左右，之后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖系統(tǒng)架上喂食豐年蟲(chóng)，養(yǎng)殖系統(tǒng)上的斑馬魚(yú)1天喂食2次，早晚各1次。本文試驗(yàn)一般在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至1細(xì)胞期時(shí)進(jìn)行顯微注射。

1.1.2 主要試劑

引物由擎科生物合成，PCR高保真酶購(gòu)自擎科生物，DNA marker購(gòu)自TAKARA公司，瓊脂糖購(gòu)自BBI公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自生工生物，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，RNA純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，Cas9蛋白購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

負(fù)反轉(zhuǎn)構(gòu)造的存在說(shuō)明研究區(qū)構(gòu)造演化經(jīng)歷了由早期擠壓應(yīng)力到晚期拉張應(yīng)力的轉(zhuǎn)換。早期擠壓形成的北西向構(gòu)造帶在晚期拉張應(yīng)力作用下使研究區(qū)具備了良好的油氣成藏條件。

首先在Ensembl網(wǎng)站上(http://www.ensembl.org/index.html)獲取目標(biāo)基因的完整序列，各個(gè)轉(zhuǎn)錄本以及內(nèi)外顯子等信息。然后找出所有緊鄰5’-NGG-3’(PAM)的候選靶序列，靶序列一般大小為18～20 bp。sgRNA引物序列F基本結(jié)構(gòu)：靶序列前加保護(hù)堿基(tg)和T7啟動(dòng)子(TAATACGACTCACTATA)或Sp6啟動(dòng)子(ATTTAGGTGACACTATA)，靶序列后加sgRNA骨架序列上游序列(GTTTTAGAGGCTAGAA ATAGG)，sgRNA引物序列R：AAGCACCGACTCGGTGCCACT，根據(jù)miR-196a-1基因靶位點(diǎn)通過(guò)Primer3.0設(shè)計(jì)基因組正反檢測(cè)引物G196a-1-F和G196a-1-R(表1)。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Tab.1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 sgRNA的合成

使用通用模板(見(jiàn)表1)，以sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R為引物，在退火溫度為60 ℃，延伸時(shí)間為10 s的條件下，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得攜帶Sp6啟動(dòng)子的miR-196a-1基因靶位點(diǎn)序列1以及T7啟動(dòng)子的miR-196a-1基因靶位點(diǎn)序列2的sgRNA模板序列；PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收的PCR產(chǎn)物作為模板，用Sp6(或T7)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成sgRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收，瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)定濃度后-80 ℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點(diǎn)有效性檢測(cè)

收集15 min內(nèi)產(chǎn)的斑馬魚(yú)受精卵，待發(fā)育至1細(xì)胞期時(shí)排列在注射板上，將miR-196a-1基因靶位點(diǎn)的sgRNA1(30 ng/μL)、sgRNA2(35 ng/μL)和Cas9蛋白(150～300 ng/μL)按1∶1∶0.7比例混勻；用定量顯微注射系統(tǒng)將混合溶液(約1 nL)共注射到斑馬魚(yú)受精卵中，注射后放置到28.5 ℃的恒溫箱中；受精卵培養(yǎng)至36 h時(shí)，分別收集野生型和部分注射后胚胎進(jìn)行有效性鑒定，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至成魚(yú)。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養(yǎng)至2個(gè)月左右發(fā)育為幼魚(yú)，對(duì)幼魚(yú)逐條剪尾進(jìn)行基因型鑒定。由于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間相距132 bp，如果兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，就會(huì)造成較大片段的缺失。用基因組檢測(cè)引物對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR產(chǎn)物會(huì)同時(shí)出現(xiàn)野生型目的條帶以及比野生型目的條帶小100 bp左右的條帶，則這些幼魚(yú)為攜帶突變的F0代魚(yú)；將F0代幼魚(yú)繼續(xù)飼養(yǎng)1個(gè)月左右至成魚(yú)，與野生型進(jìn)行雜交，用同樣的基因型鑒定方法篩選出可穩(wěn)定遺傳的魚(yú)，這些魚(yú)為F1代突變體?；蛐丸b定后，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，將F1代突變體中比野生型目的條帶小的條帶進(jìn)行切膠回收，并送公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析突變位點(diǎn)和突變的堿基數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-196a-1基因生物保守性分析

首先在NCBI網(wǎng)站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找miR-196a-1基因在各個(gè)物種中的序列，并將序列下載，利用blast比對(duì)各個(gè)物種的miR-196a-1基因序列，并找出保守序列。在miRBase網(wǎng)站上(https://www.mirbase.org)查找種子序列，與各個(gè)物種的miR-196a-1基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)物種的miR-196a-1基因的種子序列高度保守(見(jiàn)圖1)。

2.2 miR-196a-1基因靶位點(diǎn)確定

按1.2.1所述的方法在miR-196a-1基因序列上選擇基因敲除位點(diǎn)(見(jiàn)圖2)，靶位點(diǎn)序列前加保護(hù)堿基和啟動(dòng)子序列，靶位點(diǎn)序列后加sgRNA骨架上游序列，將此作為正向引物sgRNA1-F和sgRNA2-F。sgRNA骨架下游序列作為反向引物sgRNA-R。

圖1 各個(gè)物種間miR-196a-1基因生物保守性分析Fig.1 Bioconservative analysis of miR-196a-1 gene among species加粗部分為保守序列區(qū)，序列標(biāo)紅處為種子序列。miR-196a-1種子序列區(qū)高度保守The bold part showed the conserved sequence region, and the red part of the sequence is the seed sequence. The miR-196a-1 seed sequence is highly conserved

圖2 miR-196a-1基因靶位點(diǎn)示意圖Fig.2 The design diagram of miR-196a-1 gene targeting site以上序列是miR-196a-1基因序列的一部分，大寫(xiě)加粗部分為外顯子，小寫(xiě)未加粗部分為內(nèi)含子；下劃線為直線的表示靶位點(diǎn)序列，下劃線為雙直線的表示為PAM序列；下劃線為波浪線的則是檢測(cè)引物Above is partial sequence of the miR-196a-1 gene. The capitalized with bold sequences are exons, the lower case with bold parts are introns；The sequence with single underline indicated the target site1 and target site2 sequence, respectively;The doubled underlines means PAM sequence. Underlined by wavy lines are primers for genotyping

2.3 miR-196a-1基因注射有效性檢測(cè)與分析

為了確認(rèn)靶位點(diǎn)有效，本文按方法1.2.3中所述將注射后胚胎培養(yǎng)至36 hpf (hours post fertilization)，隨機(jī)挑選5管，每管2顆胚胎，提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示，3號(hào)和4號(hào)泳道除了一條210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶，證明選擇的兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，達(dá)到基因敲除效果。

圖3 胚胎注射有效性分析Fig.3 Analysis of effectiveness of embryo injection胚胎注射有效性分析PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～5：注射胚胎基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；6：野生型對(duì)照。3和4泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)， 這說(shuō)明兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效Gel electrophoresis of PCR products for embryo injection effectiveness analysis. M:DNA marker;1～5:PCR amplification products of genomic DNA with embryo injection;6:Wild type control group. In addition to a bright 210 bp wild-type band in lanes 3 and 4, there is a weaker band (indicated by a black arrow) below, indicating that both target sites are valid

2.4 F0代突變體篩選

將注射有效的剩余胚胎養(yǎng)至成魚(yú)，對(duì)成魚(yú)逐條剪尾提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)分析(見(jiàn)圖4)。結(jié)果顯示第8號(hào)泳道除了一條210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶。

圖4 F0代兩個(gè)月幼魚(yú)篩選Fig.4 F0 generation two months juvenile screeningM：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～9：兩個(gè)月幼魚(yú)剪尾提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；10：野生型對(duì)照。第8號(hào)泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)M:DNA marker;1～9:PCR amplified products using two months juvenile genomic DNA injected with miR-196 guide RNAs;10:Wild type control. In addition to a bright 210 bp wildtype band, lane 8 has a weaker band below (Indicated by the black arrow)

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

本試驗(yàn)將篩選到的第8號(hào)F0代突變體與野生型斑馬魚(yú)雜交，得到F1代魚(yú)，收集5管F1代胚胎，每管2顆，提取基因組DNA做PCR擴(kuò)增并凝膠鑒定，結(jié)果如圖5a所示，發(fā)現(xiàn)除了210 bp的野生型條帶外，下方有一條100 bp左右的條帶，說(shuō)明第8號(hào)F0代突變體可穩(wěn)定遺傳。將該100 bp左右的條帶進(jìn)行切膠回收并送公司測(cè)序，峰圖顯示兩個(gè)靶位點(diǎn)都出現(xiàn)缺失，結(jié)果如圖5b所示。測(cè)序序列在NCBI blast 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變體的兩個(gè)靶位點(diǎn)之間缺失了103 bp堿基，證明兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，并造成大片段的缺失，結(jié)果如圖5c所示。將剩余的F1代胚胎養(yǎng)成2個(gè)月的幼魚(yú)，再逐條剪尾提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定，結(jié)果如圖5d所示，獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代魚(yú)。

圖5 F1代突變體篩選Fig.5 F1 generation mutant screening(a)F1代胚胎PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～9：注射胚胎sgRNA后，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；10：野生型對(duì)照。第1、3、7號(hào)泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)。證明F0代突變體篩選的8號(hào)魚(yú)可產(chǎn)生能穩(wěn)定遺傳的突變后代；(b)F1代胚胎PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖。將基因敲除條帶的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，峰值圖中：“----”代表第一號(hào)靶位點(diǎn)序列，基因敲除后，第一號(hào)靶位點(diǎn)缺失了7個(gè)堿基?！啊贝淼诙?hào)靶位點(diǎn)序列，第二號(hào)靶位點(diǎn)缺失了8個(gè)堿基；(c)測(cè)序序列比對(duì)結(jié)果圖。發(fā)現(xiàn)第一號(hào)靶位點(diǎn)和第二號(hào)靶位點(diǎn)之間缺失103 bp，包括第一號(hào)靶位點(diǎn)缺失了7個(gè)堿基，第二號(hào)靶位點(diǎn)缺失了8個(gè)堿基以及第一號(hào)與第二號(hào)靶位點(diǎn)中間的堿基；(d)F1代突變體成魚(yú)PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；1～23泳道：注射胚胎基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；24泳道：野生型對(duì)照。第1、3、10、12、19號(hào)泳道除了有一條明亮的210 bp的野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶(黑色箭頭指示)(a)Gel electrophoresis of PCR products using F1 embryos as genomic DNA. M:DNA marker;1～9:PCR products using genomic DNA injected with sgRNA;10:Wild type control. In addition to a bright 210 bp wild-type band,there was a weaker band below in lanes 1, 3, and 7 (indicated by the black arrow). The fish No.8 selected by the F0 mutant can produce mutant offspring that can be stably inherited;(b) The F1 generation mutant embryo PCR product sequencing peak map, the small band of PCR product was purified and sent to the company for sequencing, “----”indicated the first target site sequence,7 bases missing from target site 1；“”marked the second target site sequence,7 bases missing at target 2;(c)Mutant sequence was compared with the control in the NCBI blast datebase,103 bp was missing between the first and second target sites;(d)Gel electrophoresis of PCR products of F1 adult mutant fish. M:DNA marker;1～23:PCR amplified product of genomic DNA with embryo injection;24:Wildtype control. Inaddition to a bright 210 bp wildtype band, there was a weaker band below in lanes 1, 3, 10, 12, 19 (indicated by the black arrow)

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)面世之前，一般采用鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc-finger nucleases，ZFN)和基因打靶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)進(jìn)行基因編輯，但ZFN和TALEN基因打靶技術(shù)存在很大的局限性。ZFN基因打靶技術(shù)操作過(guò)程十分復(fù)雜，并且一次不能對(duì)多個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，打靶效率不高。在構(gòu)建動(dòng)物模型的過(guò)程中，需要多次構(gòu)建表達(dá)載體，構(gòu)建載體過(guò)程繁瑣，試驗(yàn)周期太長(zhǎng)[24-26]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相比前兩種技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、高效，大大縮短了試驗(yàn)周期，一經(jīng)面世，就被廣泛應(yīng)用。本文用斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除miR-196a-1基因，斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的簡(jiǎn)單操作，采用Cloning free技術(shù)，不需要進(jìn)行載體的構(gòu)建，只需以寡聚核苷酸作為模板進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物純化回收后直接作為合成sgRNA的模板，簡(jiǎn)化了基因敲除的過(guò)程，大大提高了試驗(yàn)效率，降低了試驗(yàn)過(guò)程中潛在的風(fēng)險(xiǎn)。本文選用了兩個(gè)靶位點(diǎn)，采取了注射一對(duì)sgRNA的方式，如果兩個(gè)靶位點(diǎn)都有效，可以造成大片段的缺失，對(duì)斑馬魚(yú)易回復(fù)突變的特點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)償作用，敲除結(jié)果也可在瓊脂糖凝膠電泳中直觀地觀察到，無(wú)需單個(gè)檢測(cè)。但CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有易脫靶的局限性，這就需要對(duì)目的基因的敲除蛋白結(jié)構(gòu)域和靶位點(diǎn)的選擇有更高的要求。

因?yàn)轱@微注射后的F0代胚胎為嵌合體，其突變不一定能夠遺傳到下一代，因此不直接對(duì)F0代突變體測(cè)序。篩選到的F0代突變體只進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，將鑒定有突變的個(gè)體與野生型斑馬魚(yú)雜交產(chǎn)生F1代，提取F1代胚胎基因組DNA做PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，隨后送公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，確定敲除位點(diǎn)和數(shù)量。

F1代突變體能夠穩(wěn)定遺傳，將F1代雜合突變體自交，經(jīng)基因型鑒定，出現(xiàn)25%的純合子，與預(yù)期結(jié)果相符合。將F1代miR-196a-1基因雜合突變體成魚(yú)自交，觀察F2代miR-196a-1基因純合突變胚胎，其外表發(fā)育正常，未出現(xiàn)明顯表型(圖6)，這說(shuō)明缺失后不影響整體胚胎發(fā)育，導(dǎo)致miR-196a-1突變后斑馬魚(yú)胚胎整體未出現(xiàn)明顯缺陷，但是該基因是否引起細(xì)微結(jié)構(gòu)異常尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。該基因可能還有其他的miRNAs起著代償作用，共同降解靶基因。在后續(xù)的研究中，應(yīng)在miR-196a-1基因敲除模型上進(jìn)一步敲除其它相關(guān)的miRNAs，觀察這些基因在調(diào)控斑馬魚(yú)腸道發(fā)育中的功能。本研究第一次成功構(gòu)建了miR-196a-1基因敲除斑馬魚(yú)模型，為后續(xù)的miR-196a-1基因功能研究提供了良好的研究基礎(chǔ)。

圖6 miR-196a-1基因純合突變體表型 (50 ×)Fig.6 Phenotype of miR-196a-1 null mutant (50 ×)(a)野生型對(duì)照組；(b)miR-196a-1基因純合突變體。結(jié)果顯示miR-196a-1基因純合突變體與野生型相比，外表沒(méi)有明顯變化(a)Wild-type control group;(b)Homozygous mutant of the miR-196a-1 gene. The results showed that the miR-196a-1 homozygous mutant had no obvious difference compared to the wild type