骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液促進STAT3磷酸化誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞向M2型極化

李志偉，周號悅，劉湘粵，何 漪，丁小鳳，胡靈玉

(1.湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室， 長沙 410081;2.湖南省南華生物醫(yī)藥研究所， 長沙 410015； 3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院， 長沙 410013)

炎癥是免疫細(xì)胞對病原微生物發(fā)生的免疫反應(yīng)，也是人體對外源性入侵的微生物的一種防御反應(yīng)。炎癥是機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的一種表現(xiàn)，但炎癥對機體的健康會造成傷害。巨噬細(xì)胞在炎癥發(fā)生的過程中，扮演著重要的作用，它是免疫的第二道防線，能夠吞噬、殺傷和清除外源性病原微生物。據(jù)報道巨噬細(xì)胞具有消退炎癥、修復(fù)組織等功能[1]。巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮與周圍微環(huán)境相關(guān)，微環(huán)境中的細(xì)胞因子、微生物等可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向不同的方向極化，從而發(fā)揮不同的功能[2]。巨噬細(xì)胞的M1型和M2型表型已被公認(rèn)，M1型和M2型兩亞型功能相反，M1型能夠產(chǎn)生多種促炎因子，比如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)，而M2型巨噬細(xì)胞則產(chǎn)生多種抑炎因子來緩解炎癥[3]。巨噬細(xì)胞存在一系列連續(xù)的功能狀態(tài)，M1型和M2型是連續(xù)狀態(tài)的兩個極端，在不同條件下，這兩種極端可以相互轉(zhuǎn)化[4]。Nahrendor等[5]發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死過程中巨噬細(xì)胞的M1/M2表型會轉(zhuǎn)化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)是從骨髓中提取的一類間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有分化能力的多能干細(xì)胞，能夠分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉等多種組織細(xì)胞，同時具有促進傷口愈合與再生的能力[6]。它主要來源于臍帶、脂肪、骨髓等[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性，對機體中的免疫細(xì)胞具有重要的免疫調(diào)控作用[8,9]。有研究證實，MSCs主要通過影響參與炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞增殖、分化和炎性因子分泌來進行免疫調(diào)控[10,11]，但是其免疫調(diào)控機制復(fù)雜，尚未完全明確。因此探究間充質(zhì)干細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的影響，是否能促進巨噬細(xì)胞向分泌抑炎因子的M2型極化具有重要的研究意義。本研究利用培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture medium，BMSC-CM)處理M1型巨噬細(xì)胞Raw264.7，探究BMSC-CM對巨噬細(xì)胞Raw264.7表型極化的影響以及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

3周齡C57BL/6小鼠購自湖南斯萊克景達公司。DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基、DMEM/F12[dulbecco’s modified eagle medium nutrient mixture F-12(Ham)]培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰酶、青霉素和鏈霉素雙抗均來自Gibco公司(Gibco，USA)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)來自Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich，USA)。RNA提取試劑Trizol(Takara，Japan)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，USA)，氯仿(瀘試試劑，上海)，異丙醇和乙醇來自恒興試劑公司(恒興試劑，天津)，1.1×T3 Super PCR Mix試劑、瓊脂糖和引物均購自擎科生物公司(擎科生物，北京)。細(xì)胞裂解液RIPA試劑(碧云天，上海)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)和蛋白質(zhì)定量BCA試劑盒來自生工生物公司(生工生物，上海)。蛋白免疫印跡所用的抗體包括：anti-STAT3 兔單克隆抗體(生工試劑，上海)；anti-tubulin兔單克隆抗體(Sigma-Aldrich，USA)；anti-p-STAT3兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology，USA)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abmart，UAS)；化學(xué)發(fā)光ECL試劑(Advansta，USA)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取參考Zhu等[12]的方法，稍有改進。選取雌雄不限的3周齡C57BL/6小鼠，頸 椎脫臼法處死；用75%酒精浸泡處死的小鼠1 min，取小鼠股骨和脛骨放置在盛有預(yù)冷的PBS的培養(yǎng)皿中，用PBS清洗股骨與脛骨2次，洗去附著在上面的小塊的肌肉組織；將股骨與脛骨的兩側(cè)骨端剪去，用1 mL的注射器吸入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，從股骨或脛骨的一側(cè)打出至培養(yǎng)皿中，重復(fù)沖洗直至股骨或脛骨發(fā)白；收集沖洗的培養(yǎng)液,3 048 r/min離心5 min，棄掉上清液，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每間隔8 h，更換培養(yǎng)液，此步驟重復(fù)3次，此步驟是將造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞等懸浮的細(xì)胞去除得到純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞達到80%～90%融合時進行傳代。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(BMSC-CM)的制備

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至第2、3代，當(dāng)細(xì)胞達到80%～90%融合時，使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后吸取培養(yǎng)液，16 697 r/min離心10 min，取上清液，保存于-20 ℃，細(xì)胞常規(guī)傳代。

1.4 Raw264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

Raw264.7細(xì)胞為本實驗室凍存，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。試驗分為DMEM培養(yǎng)組(DMEM組)、BMSC-CM培養(yǎng)組(BMSC-CM組)、LPS刺激DMEM培養(yǎng)組(LPS+DMEM組)、LPS刺激BMSC-CM培養(yǎng)組(LPS+BMSC-CM組)。當(dāng)Raw264.7細(xì)胞融合至50%時，DMEM組和BMSC-CM組常規(guī)換液，LPS+DMEM組和LPS+BMSC-CM組更換添加1 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；12 h后，DMEM組和LPS+DMEM組更換DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，BMSC-CM組和LPS+BMSC-CM組更換含50%BMSC-CM的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，提取總RNA進行半定量PCR，提取總蛋白進行Western 蛋白質(zhì)印跡試驗。

1.5 RNA提取以及半定量PCR

按1.4的步驟處理的Raw264.7細(xì)胞，采用Trizol試劑提取各組的RNA。首先將各組細(xì)胞用PBS清洗1遍，再加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，加入250 μL氯仿后充分震蕩并靜置5 min；4 ℃、11 807 r/min離心10 min，收集上清液加入350 μL異丙醇，室溫靜置10 min后，在4 ℃下11 807 r/min離心10 min，棄上清并用1 mL預(yù)冷的75%乙醇充分洗滌沉淀，離心去掉乙醇；待乙醇揮發(fā)后，用RNase free水溶解RNA，測定在260和280 nm的吸光值(A)，以A260/A280確定RNA濃度，比值在1.8～2.0內(nèi)。按照GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒操作說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA鏈，以2 μg的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:20 μL，擴增程序為25 ℃，5 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。得到的cDNA用滅菌水稀釋5倍作為半定量PCR的模板。使用1.1×T3 Super PCR Mix試劑進行半定量PCR，半定量PCR擴增程序為：預(yù)變性98 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共28個循環(huán)。最后取20 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，以小鼠GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脫氫酶)mRNA作為內(nèi)參，計算樣品的mRNA相對表達量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for PCR

1.6 蛋白提取及Western蛋白質(zhì)印跡檢測

按1.4的步驟處理的Raw264.7細(xì)胞，去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，收集用胰蛋白酶消化后的細(xì)胞，用PBS清洗3次，加入RIPA試劑提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液后105 ℃變性10 min，制備12%聚丙烯酰胺膠，取40 μg蛋白上樣電泳。濕法電轉(zhuǎn)移80 min，5%脫脂牛奶TBST封閉后，孵育稀釋的一抗：anti-tubulin兔單克隆抗體(1∶5 000)、anti-STAT3 兔單克隆抗體(1∶500)、anti-p-STAT3兔單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃輕微搖晃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL試劑顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)分析采用Student’st-test檢測。誤差線表示3個獨立的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

重懸細(xì)胞培養(yǎng)24 h對細(xì)胞進行換液后，如圖1所示，在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞貼壁生長，多數(shù)細(xì)胞呈圓形，部分呈不規(guī)則形狀；培養(yǎng)至第4 d時，顯微鏡視野下細(xì)胞之間間隙較寬，細(xì)胞攤開伸出偽足向梭形形狀生長；培養(yǎng)至第7 d時，細(xì)胞大多數(shù)呈梭形，且細(xì)胞開始聚集；培養(yǎng)至第10 d時，細(xì)胞呈梭形且形態(tài)均一，細(xì)胞聚集呈漩渦狀。第一代細(xì)胞細(xì)長呈長梭形，胞體小，并且偽足較少；第五代和第十代的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小、偽足數(shù)量和第一代比較無明顯變化，細(xì)胞均呈梭形，匯合時呈漩渦狀，細(xì)胞活力高，增殖速度較快。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞各時期細(xì)胞形態(tài)(比例尺1∶400 μm，×10)Fig.1 Cell morphology of bone marrow mesenchymal stem cells at various stages (scale 1∶400 μm，×10)(a)24 h；(b)第4天；(c)第7天；(d)第一代；(e)第五代；(f)第十代(a)24 h;(b)4 d;(c)7 d;(d)The first generation;(e)The fifth generation;(f)The tenth generation

2.2 MSC-CM對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞分型相關(guān)標(biāo)記分子mRNA相對表達量的影響

根據(jù)文獻報道，巨噬細(xì)胞M1型和M2型的分型可以通過檢測相關(guān)標(biāo)志因子的表達來區(qū)分，M1型的促炎因子TNF-α和INOS表達較高，而M2型的抑炎因子精氨酸1(arginase 1，ARG-1)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)表達較高[13]。如圖2所示，MSC-CM組和LPS+MSC-CM組M1型的相關(guān)標(biāo)記分子TNF-α和INOSmRNA表達比DMEM組和LPS+DMEM組明顯下降，而且這兩組M2型的相關(guān)標(biāo)記分子ARG-1和TGF-β1mRNA表達比DMEM組和LPS+DMEM組明顯上升。從檢測標(biāo)志基因mRNA水平上可以說明，LPS組巨噬細(xì)胞處于M1型狀態(tài)，而MSC-CM處理的Raw264.7細(xì)胞由M1型向M2型狀態(tài)極化。

圖2 M1型和M2型相關(guān)標(biāo)志因子mRNA表達水平Fig.2 M1 and M2 related marker factor mRNA expression levels(a)半定量PCR檢測TNF-α, INOS, ARG-1和TGF-β1 mRNA表達水平；(b)對a圖的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。星號示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)(a)Detection of TNF-α, INOS, ARG-1 and TGF-β1 mRNA expression levels by semi-quantitative PCR;(b)Statistical analysis of the data of the Fig.a. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)

2.3 MSC-CM對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞IL-10 mRNA水平以及STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響

由2.2的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)MSC-CM可以誘導(dǎo)Raw264.7向M2型極化的現(xiàn)象，進一步探究這一現(xiàn)象的具體分子機制。查閱文獻得知M2型巨噬細(xì)胞可高分泌IL-4和IL-10等細(xì)胞因子[14,15]，因此推測可能與IL-10/STAT3信號通路有關(guān)。半定量PCR檢測IL-10mRNA水平和Western blot檢測p-STAT3和STAT3蛋白水平，結(jié)果如圖3所示，兩組MSC-CM處理的Raw264.7的IL-10mRNA水平相對比其他兩組表達明顯上升。而p-STAT3蛋白水平的趨勢與IL-10mRNA水平趨勢一致，使用MSC-CM培養(yǎng)處理的細(xì)胞p-STAT3蛋白表達比LPS/DMEM組明顯上調(diào)，各組的STAT3蛋白無明顯變化。試驗結(jié)果說明，MSC-CM誘導(dǎo)Raw264.7向M2型極化的分子機制是通過促進STAT3磷酸化來激活I(lǐng)L-10/STAT3信號通路的進行。

圖3 檢測STAT3和p-STAT3蛋白表達水平和 IL-10 mRNA表達水平Fig.3 Detection of STAT3 and p-STAT3 protein expression levels and IL-10 mRNA expression levels(a)蛋白免疫印跡檢測STAT3和p-STAT3蛋白水平。星號示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05，** P<0.01，**** P<0.000 1)；(b)半定量PCR檢測IL-10 mRNA水平。星號示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05，** P<0.01)(a)Western blotting detects STAT3 and p-STAT3 protein levels. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05, ** P<0.01,**** P<0.000 1);(b)Semi-quantitative PCR detects IL-10 mRNA levels. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05, ** P<0.01)

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我更新和分化能力的多能干細(xì)胞，它易獲取，增殖能力強，具有免疫抑制作用[16]。因此MSC是細(xì)胞治療中一種非常有吸引力的載體[10]。MSC可以從多種組織中分離出來，比如臍帶、脂肪和骨髓，但與其他組織來源獲取MSC相比,從骨髓中分離操作相對簡單，且易獲取大量MSC[6]。小鼠作為模式生物之一，它與人類具有高度的同源性，因此從小鼠骨髓中獲取MSC是研究BMSC功能性有效的細(xì)胞模型。MSC細(xì)胞治療的難度在于如何在體外培養(yǎng)維持MSC活性和干細(xì)胞功能性[17]。MSC在出現(xiàn)衰老時，其代謝特征將會改變[18,19]。BMSC衰老過程中的遺傳損傷會隨之積累，這將減弱干細(xì)胞的可用性和功能[20]。因此，BMSC的活性維持和擴增后干細(xì)胞功能性保持是研究BMSC的基礎(chǔ)。目前文獻報道小鼠BMSC大多數(shù)是來源4～8周齡小鼠，隨著小鼠的生長發(fā)育，體內(nèi)的干細(xì)胞分化能力和活力將會隨之發(fā)生改變。隨著鼠齡增大，其來源的BMSC活力和分化能力將會下降。本研究采用3周齡C57BL/6鼠為試驗對象，3周齡的C57BL/6鼠處于剛斷奶狀態(tài)，其發(fā)育不齊全，且體型偏小，利用這些特點很容易提取活力強的BMSC。在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)BMSC能夠擴增至十代，且細(xì)胞形態(tài)、大小不發(fā)生改變，其促進STAT3磷酸化誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞向M2型極化的生物功能也不會發(fā)生改變。由此可知，通過本研究中提取BMSC的方法能夠有效維持BMSC活性以及干細(xì)胞功能。

巨噬細(xì)胞在淋巴組織和非淋巴組織中都存在，被認(rèn)為其通過清除凋亡細(xì)胞和分泌生長因子維持穩(wěn)態(tài)[21]。巨噬細(xì)胞具有病原體識別受體，能夠有效吞噬病原體并能誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性因子參與免疫反應(yīng)[1,22]。有關(guān)研究表明，巨噬細(xì)胞存在一系列連續(xù)的功能狀態(tài)，M1型和M2型是連續(xù)狀態(tài)的兩個極端[3]。通常認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，在免疫反應(yīng)中提呈抗原和吞噬病原體，從而引發(fā)炎癥；M2型巨噬細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10等下調(diào)免疫應(yīng)答，起到抑制炎癥的作用[23]。M1型巨噬細(xì)胞表達TNF-α和INOS比M2型明顯升高，而M2型巨噬細(xì)胞ARG-1的表達水平比M1型顯著提高[14,15]，因此檢測巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記可以鑒定巨噬細(xì)胞的狀態(tài)。本研究中利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Raw264.7，檢測巨噬細(xì)胞TNF-α和INOS標(biāo)志因子，結(jié)果顯示TNF-α和INOSmRNA表達上升，表明巨噬細(xì)胞處于能夠?qū)е卵装Y發(fā)生的M1型，再用BMSC-CM處理巨噬細(xì)胞，研究BMSC-CM是否能夠抑制炎癥，結(jié)果表明，使用BMSC-CM處理的巨噬細(xì)胞的ARG-1和TGF-β表達上升，表明巨噬細(xì)胞處于M2型。

有關(guān)文獻報道STAT3是調(diào)節(jié)抗炎因子IL-10的轉(zhuǎn)錄因子，在抑制炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮很重要的調(diào)控作用[24,25]。STAT3屬于STAT家族中一員[26]，而JAK-STAT信號通路是由細(xì)胞因子調(diào)控激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、免疫以及凋亡等生物學(xué)過程[27,28]。研究表明，一類細(xì)胞因子可以調(diào)控多種JAK激酶，但是細(xì)胞因子對STAT家族蛋白的激活具有特異性，例如IL-1選擇性激活STAT-1，IL-4特異性激活STAT-6，IL-10特異性激活STAT-3[29]。我們查閱大量文獻，最終推測BMSC-CM對Raw264.7向M2型極化可能是通過IL-10/STAT-3通路誘導(dǎo)的。我們半定量PCR檢測對照組和試驗組的IL-10mRNA水平，結(jié)果顯示BMSC-CM處理的Raw264.7的IL-10表達上升；根據(jù)這一結(jié)果，我們檢測了各組的p-STAT3蛋白水平，結(jié)果顯示BMSC-CM可以上調(diào)p-STAT3，對STAT3的影響沒有明顯的調(diào)控作用。這與之前檢測M1型和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志因子結(jié)果相對應(yīng)，因此可以說明BMSC-CM主要是通過激活STAT3磷酸化參與IL-10/STAT3通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Raw264.7細(xì)胞向M2型極化，從而發(fā)揮抑制炎癥的功能。

綜上所述，從3周齡C57BL/6鼠的骨髓中分離的BMSC活性較好,而且能夠持續(xù)十代維持其干細(xì)胞功能，提取培養(yǎng)BMSC的上清液處理由LPS誘導(dǎo)的M1型Raw264.7細(xì)胞，試驗證明，BMSC-CM能夠有效緩解炎癥的發(fā)生，主要是促進STAT3磷酸化通過IL-10/STAT3信號通路來誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而達到抑制炎癥的效果。但進一步思考可發(fā)現(xiàn)BMSC能夠分泌許多類型的細(xì)胞因子，具體哪種細(xì)胞因子促進STAT3磷酸化暫時還沒有得到結(jié)論，因此從BMSC分泌的細(xì)胞因子中篩選出有效抑制炎癥的細(xì)胞因子，再體外培養(yǎng)能夠大量分泌該種細(xì)胞因子的BMSC，這將是一個更有意義、更有趣的研究。