基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對扶正化瘀膠囊入血成分的快速鑒別

邢心睿，曹 奇，陳 思，朱臻宇 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 2004；2.臨沂市檢驗(yàn)檢測中心，山東 臨沂27607；.解放軍 20 醫(yī)院，遼寧 大連 6000）

扶正化瘀膠囊（舊名扶正化瘀方）是針對肝纖維化“正虛血瘀”的基本病機(jī)研制而成的[1],該復(fù)方由丹參、桃仁、五味子、冬蟲夏草、絞股藍(lán)、松花粉六味藥材組成[2-7]，丹參在方中活血祛瘀作為君藥,冬蟲夏草補(bǔ)虛損、益精氣，桃仁助丹參活血祛瘀，共為臣藥，松花粉益氣潤燥，絞股藍(lán)清熱解毒，兩者共為佐藥；五味子味酸，為引經(jīng)使藥。從中醫(yī)角度出發(fā)，丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子這六味藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要包含脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類、多糖、甾醇、多種氨基酸、多種維生素、揮發(fā)油、木脂素等物質(zhì)。以上六味藥合用共奏活血化瘀、益精養(yǎng)肝之功效，適用于肝纖維化證屬“瘀血阻絡(luò)，肝腎不足”者[8]。其臨床療效顯著，已受國家發(fā)明專利保護(hù)，獲得國家中藥Ⅲ類新藥證書。而且2006年扶正化瘀片通過美國食品藥品監(jiān)督管理局審批，免于進(jìn)行Ⅰ期臨床，直接進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，并在2013年圓滿完成Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，成為肝病領(lǐng)域中首個(gè)通過美國Ⅲ期臨床試驗(yàn)的中成藥[9]，將來也有望成為第一個(gè)獲準(zhǔn)進(jìn)入美國主流醫(yī)藥市場的復(fù)方中藥。(標(biāo)紅的5處字體均用羅馬字)

該復(fù)方在我國已使用多年，但由于其組分復(fù)雜，一直缺乏系統(tǒng)性研究，盡管目前關(guān)于該復(fù)方作用機(jī)制報(bào)道較多[10-15]，然而對于整個(gè)復(fù)方的入血成分還未見報(bào)道。而且復(fù)方組成復(fù)雜，比分析單位藥材的入血成分更困難，因此，明確扶正化瘀膠囊各部分的入血成分對于該復(fù)方治療效果、作用機(jī)制的深入研究具有重要意義。

UHPLC和Q-TOF/MS的串聯(lián)技術(shù)在中藥復(fù)方等復(fù)雜體系研究中占有一定優(yōu)勢，該技術(shù)集色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏、高分辨、強(qiáng)定性能力于一體，已經(jīng)成為中藥復(fù)方化學(xué)成分分析和鑒定的有效手段之一[16-18]。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLCQTOF/MS技術(shù)首次對扶正化瘀膠囊中的入血成分進(jìn)行快速分析，并對其成分進(jìn)行藥材歸屬鑒定，進(jìn)一步闡明了扶正化瘀膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity 液相系統(tǒng)，包括 G4220A四元泵、G4226自動(dòng)進(jìn)樣器G1316C柱溫箱（安捷倫科技有限公司，美國）；Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離 子 源 （ ESI） 及 MassHunter Qualitative Analysis Software 分析工作站（安捷倫科技有限公司，江蘇）；JY10001十萬分之一電子天平（精密科學(xué)儀器有限公司，上海）；Heal Force SMART-N 超純水機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，香港）；Micro 17 高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國）；甲醇、乙腈均為色譜純試劑（Merck，德國），甲酸為色譜級試劑（ROE scientific INC，美國），水為實(shí)驗(yàn)室制備的超純水，其他試劑均為分析級。

1.2 藥品與試劑

丹參素、丹酚酸B、二氫丹參酮I、丹酚酸A、五味子乙素、苦杏仁苷、腺苷、五味子醇甲、絞股藍(lán)皂苷XLIX、山奈酚對照品（一飛生物科技有限公司，純度≥98%），批號分別為：76822-21-4、121521-90-2、 87205-9-0、 96574-01-5、 61281-37-6。扶正化瘀膠囊（黃海制藥有限責(zé)任公司，上海）購于益豐大藥房，批號分別為：161220、170640、171116。

1.3 混合對照品溶液的制備

取丹參素、丹酚酸B、二氫丹參酮I、丹酚酸A、五味子乙素對照品適量，精密稱定后，用甲醇溶解并定容成10 mg/ml的對照品儲備液。吸取各對照品溶液適量，用甲醇稀釋成各對照品濃度約2 mg/ml的對照品混合溶液。

1.4 血清樣品的采集

稱取扶正化瘀膠囊適量，配制成濃度為0.3 g/ml的混懸水溶液，供大鼠灌胃使用。取雄性SD大鼠6只，隨機(jī)分為兩組（空白組和給藥組），給藥前12 h禁食、不禁水，按照給藥體積 4 ml/kg（0.3 g/ml，臨床4倍劑量）灌胃給藥樣品，空白組灌胃蒸餾水。給藥23 min后采用眼眶取血約1.5 ml置離心管中，靜置 1 h 后，離心（3 500 r/min，10 min）后取上清液約 0.5 ml，-80 ℃ 冷凍保存。

1.5 血清樣品制備

精確吸取 50 μl血清，溶于 150 μl 含有內(nèi)標(biāo)的100% 甲醇中，渦旋30 s，靜置5 min，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液，即得血清樣品。

1.6 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters Corporation，Ireland）。流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成。梯度洗脫條件：0～3 min，2%B；3～18 min，2%～50%B； 18～22 min，50%～95% B； 22～25 min，95%B。平衡時(shí)間為 10 min，流速為 0.40 ml/min，分析所用時(shí)間為 25 min。進(jìn)樣體積設(shè)置為 3 μl，柱溫箱溫度為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度為4 ℃。

1.7 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源采用正、負(fù)離子模式。正離子模式條件：毛細(xì)管電壓 4 V；干燥氣體流速 11 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；霧化器壓力45 psig；碎片電壓 120 V；skimmer電壓 60 V。質(zhì)譜采集范圍從100～1 100m/z，參比離子為 121.051 和 922.010m/z。負(fù)離子模式下，除了毛細(xì)管電壓為 3.5 kV，其余條件與正離子模式相同。負(fù)離子模式下的參比離子分別為 119.036 3 和 966.000 7m/z。

1.8 扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

根據(jù)國內(nèi)外已有的專業(yè)數(shù)據(jù)庫TCM@taiwan、TCMID（traditional Chinese medicine integrative database）和上海中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)研究文獻(xiàn)，共收集了扶正化瘀膠囊六味藥材中801個(gè)化學(xué)成分。利用Agilent公司研發(fā)的“Formula-Database-Generator”軟件，通過各化學(xué)成分包含碳、氫、氧的個(gè)數(shù)，計(jì)算化合物精確的相對分子質(zhì)量，建立化學(xué)成分的分子式和相對分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清樣品總離子流圖

精密吸取扶正化瘀膠囊血清樣品溶液和對照品混合溶液200 μl于進(jìn)樣小瓶，按照上述質(zhì)譜和色譜測試條件進(jìn)行樣品分析。同時(shí)檢測空白血清、混合對照品溶液和含藥血清在正離子檢測模式下的總離子流圖，如圖1所示。

2.2 利用對照品鑒別化合物

利用實(shí)驗(yàn)中已有的對照品，無差別鑒別出血清中二氫丹參酮 I（峰 3）、五味子乙素（峰 5），如圖1B、1C。

2.3 化合物鑒別

以正離子模式下3號峰二氫丹參酮I為例，說明扶正化瘀膠囊中的色譜峰鑒別過程。TIC圖中的保留時(shí)間為10.453 min（圖1B），色譜峰顯示的準(zhǔn)分子離子峰為 279.101，利用 Qualiative Analysis軟件分析工具（calculator）精確計(jì)算質(zhì)量數(shù)可能的元素組成（＜5 ppm），結(jié)合數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的化合物質(zhì)核比，可以初步確定分子式為C18H14O3。通過計(jì)算準(zhǔn)分子離子的核素分布情況，得出同位素分布的理論值與實(shí)際值吻合良好，確定此峰為二氫丹參酮I（圖2）。

2.4 扶正化瘀膠囊中入血成分的鑒別結(jié)果

根據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜測得的精確相對分子質(zhì)量，比對所建的扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，應(yīng)用Qualiative Analysis質(zhì)譜分析軟件計(jì)算分子組成，將理論值與實(shí)測值進(jìn)行比對，結(jié)合上述對照品鑒別結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]，對扶正化瘀膠囊血清供試品在正、負(fù)離子模式下所得的色譜圖中色譜峰進(jìn)一步分析，其中，血清供試品在正離子模式下初步鑒別出43個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表1。在負(fù)離子模式下初步鑒別出10個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表2。其中，正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)的有4個(gè)（表中標(biāo)①）。對于化學(xué)成分的藥材歸屬，見表1。

圖 1 空白血清（A）、混合對照品溶液（B）、含藥血清（C）在正離子模式下的總離子流圖

圖 2 正離子模式下二氫丹參酮Ⅰ的準(zhǔn)確分子質(zhì)量及同位素分布圖

表 1 入血化學(xué)成分的正離子模式鑒別結(jié)果

(續(xù)表 1)

表 2 入血化學(xué)成分的負(fù)離子模式鑒別結(jié)果

3 結(jié)論

本研究首次運(yùn)用UHPLC-Q-TOF/MS對扶正化瘀膠囊入血成分進(jìn)行分析，該方法效率高、穩(wěn)定性好、靈敏度高，能快速檢測出含量較低的化學(xué)成分，優(yōu)于其他方法。利用該技術(shù)快速初步鑒別出扶正化瘀膠囊血清供試品共49個(gè)化學(xué)成分，推測其可能為扶正化瘀膠囊發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。已鑒別出的化學(xué)成分主要集中在丹參、冬蟲夏草，符合中藥復(fù)方“君臣佐使”的配伍原則。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，擬進(jìn)一步從 49 種入血成分篩選出抗肝纖維化的體內(nèi)、外活性測試，期望篩選出具有抗肝纖維化的活性單體。該研究進(jìn)一步將相應(yīng)物質(zhì)的色譜峰明確化，為扶正化瘀膠囊的深入研究奠定了良好基礎(chǔ)。