月腺大戟素A通過干擾PKD1介導的MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路抑制乳腺癌細胞增殖的研究

周 瑾，李盛建，覃福禮，楊新穎，張曉琳，趙 亮 （.上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院藥劑科，上海 0908；.廣西醫(yī)科大學藥學院藥理教研室，廣西 南寧 500；.上海市寶山區(qū)友誼街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 0999）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來已經(jīng)成為致女性死亡的第二大原因[1]。雖然臨床研究人員和基礎科學家對乳腺癌進行了廣泛研究，同時手術(shù)切除、放射性同位素治療、化學藥物治療、自體免疫細胞治療、靶向治療等技術(shù)也已經(jīng)成功應用于乳腺癌患者的治療[2]。然而，這些傳統(tǒng)的治療方法大多存在副作用，因此有必要尋找新方法來改善患者預后和生活質(zhì)量。由于中藥中含有復雜的化合物，且在多種人體疾病中發(fā)揮作用，因此，中藥在癌癥患者的康復及術(shù)后放/化療的輔助治療等方面越來越引起人們的關注。

月腺大戟（Euphorbia ebracteolataHayata）為金虎尾目大戟科大戟屬的多年生草本植物，多分布在土坡、草地或者林下。在我國的安徽、河南、江蘇、山東、湖北省常見。月腺大戟作為傳統(tǒng)中藥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，到目前為止已經(jīng)有2 000多年歷史，它以根入藥，具有逐水祛痰、散結(jié)殺蟲的功效，可治療水腫、哮喘、消化不良、皮癬等疾病。近來發(fā)現(xiàn)研究中藥月腺大戟中的提取物具有抗腫瘤活性。月腺大戟中含有多種化學成分，包括萜類、脂類、酚類、苯乙酮類、黃酮類以及鞣質(zhì)類。本課題組前期實驗中，從月腺大戟中提取了一種乙酰間苯三酚類化合物月腺大戟素A（EA），并證實它能抑制乳腺癌細胞的增殖能力[3-4]。蛋白激酶D1（PKD1）是一種新型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種癌癥組織中異常表達，可以通過作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路，調(diào)控乳腺癌細胞的增殖能力[5]。但是EA如何影響乳腺癌細胞增殖能力的具體機制，以及是否通過影響PKD1從而影響乳腺癌的增殖能力均不明確。

本研究根據(jù)前期實驗對EA影響乳腺癌的具體機制的研究，結(jié)果表明EA具有通過干擾PKD1介導MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路以抑制乳腺癌細胞的增殖能力。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑

人乳腺癌MCF-7細胞（美國模式菌種收集中心，ATCC）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液（Gibco公司）；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000和 TRIzol（Invitrogen公司）；RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀公司）；CCK-8試劑（MedChemExpress公司）；RIPA裂解液（碧云天公司）；PKD1 抗體（Santa Cruz Biotechnology 公司），P-ERK1/2，ERK1/2，P-AKTAKT，GAPDH抗 體（Cell Signaling 公司）；Western Blot增強化學發(fā)光試劑盒（Millipore公司）。PKD1過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-PKD1由Genescript公司構(gòu)建，載體為pcDNA3.1。中藥月腺大戟飲片購自安徽（產(chǎn)地：山東），其中，月腺大戟素A的制備采用課題組前期實驗中的方法[4]。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與藥物處理

人乳腺癌細胞系MCF-7細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素溶液的 DMEM培養(yǎng)液中，置于 37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染時將處于對數(shù)生長期的細胞接種至6孔板中，提前混勻好轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000和質(zhì)粒pcDNA3.1-PKD1或者對照質(zhì)粒pcDNA3.1，添加至細胞培養(yǎng)板中，混勻后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。EA藥物處理時，首先將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞按照1×105個/孔的數(shù)目接種到6孔板中，待細胞貼壁后加入不同濃度的EA藥物（1、5、10、 15、 20 μmol/L）處理細胞，待進行后續(xù)試驗。

1.3 細胞增殖能力檢測

通過CCK-8實驗檢測乳腺癌細胞增殖能力的變化。首先，將轉(zhuǎn)染或加藥處理的細胞按照每孔接種 104/100 μl的濃度接種至 96 孔板中，每隔 24 h檢測一次，連續(xù)檢測3 d，同時每個處理組在每個時間點均設置3個復孔，便于統(tǒng)計分析。每次檢測前向 96孔板中添加 10 μl CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中孵育 1 h 后，放置酶標儀中震蕩 1 min，檢測其在 450 nm處的吸光值（OD）。統(tǒng)計3 d的OD值評估細胞增殖能力的變化。

1.4 RNA 提取及熒光定量 PCR 檢測（qRT-PCR）

通過qRT-PCR實驗檢測乳腺癌細胞中mRNA的表達。在轉(zhuǎn)染或加藥處理的孔板中添加TRIzol試劑，放置4 ℃搖床震蕩5 min保證細胞充分裂解。利用抽提試劑盒提取細胞中的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書在 ABI 7300實時 PCR系統(tǒng)上進行 qRTPCR檢測。反應過程中以GAPDH作為內(nèi)參，計算PKD1的相對表達量。反應中的引物序列為：PKD1，reverse, 5 ’-CCCACGTGATGGACTCAAA GA-3 ’ forward, 5 ’-AAGGGTACGGGCCTCTCAA A-3’；GAPDH，reverse, 5’-AGGGGTCTACATGGC AACTG-3’和 forward: 5’-GGCCTCCAAGGAGTAA GACC-3’。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達

通過Western Blot檢測細胞加藥或轉(zhuǎn)染后相關蛋白的表達。將加藥或者轉(zhuǎn)染處理好的細胞加入RIPA裂解液裂解提取總蛋白。收集細胞裂解液，按照BCA蛋白定量試劑盒的說明書檢測蛋白濃度。垂直電泳槽上樣的每孔中加25 μg蛋白進行凝膠電泳分離，電壓設置為80 V；待分離完成后將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)至PVDF膜，電壓設置為110 V，時間為 120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將 PVDF膜放置5%脫脂牛奶中進行封閉2 h；在4 ℃搖床中孵育一抗過夜（GAPDH以 1:5 000稀釋，PKD1以1:500稀釋，其他抗體均按照 1:1 000稀釋），用TBST洗膜3次，每次10 min；室溫搖床中用帶有HRP標記的二抗（羊抗兔IgG或者羊抗鼠IgG均按照 1:10 000 稀釋）孵育 1 h，用 TBST 洗膜 3 次，每次10 min；用ECL顯影液進行顯影。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析均采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行，數(shù)據(jù)以（±s）表示。采用Student’sttest和單因素方差分析進行組間差異的比較。檢驗水準（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 EA 抑制乳腺癌細胞中 PKD1 的表達

根據(jù)前期實驗以及報道，推測EA通過調(diào)控PKD1的表達影響乳腺癌細胞的增殖能力，因此，在本研究中首先分析經(jīng)不同濃度EA處理的乳腺癌細胞中PKD1蛋白水平的變化。結(jié)果如圖1所示，EA顯著抑制乳腺癌細胞中PKD1蛋白的表達水平（P＜ 0.05），且這種抑制呈劑量依賴性。同時，根據(jù)此實驗結(jié)果EA在15 μmol/L時能顯著降低PKD1的表達，故采用此濃度進行后續(xù)研究。

圖 1 EA 對 MCF7 細胞中 PKD1 的調(diào)控作用

2.2 PKD1 恢復 EA 對乳腺癌細胞增殖能力的抑制作用

為了進一步研究EA是否通過PKD1調(diào)控乳腺癌細胞的增殖能力，課題組首先檢測了EA的加藥效果及過表達PKD1質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果如圖2A、圖2B所示：乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒后PKD1的mRNA和蛋白水平顯著升高（P＜0.001）。結(jié)果證實過表達PKD1的轉(zhuǎn)染效率較高。研究還發(fā)現(xiàn)EA干預處理后PKD1在mRNA和蛋白水平上均受到抑制(P＜0.001)，但是此抑制作用在轉(zhuǎn)染過表達PKD1后被顯著逆轉(zhuǎn)（P＜ 0.001）。即PKD1能逆轉(zhuǎn)EA對乳腺癌細胞中PKD1表達的抑制作用。通過CCK-8實驗進一步驗證EA是否通過PKD1影響乳腺癌細胞的增殖能力。結(jié)果如圖2C所示，過表達PKD1后細胞的增殖能力顯著升高。而EA藥物干預后乳腺癌細胞的增殖能力顯著被抑制（P＜ 0.01），當轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒 PKD1 后，EA 對乳腺癌細胞的增殖抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）。

2.3 EA 通過干擾 PKD1 調(diào)控乳腺癌細胞增殖能力的機制研究

為了進一步闡明EA如何通過干擾PKD1影響乳腺癌細胞的體外增殖能力，課題組研究了PKD1調(diào)控的MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路的變化。如圖3所示：乳腺癌細胞過表達PKD1后，p-ERK1/2、p-AKT 表達水平顯著升高（P＜0.01）；當EA藥物處理后p-ERK1/2、p-AKT表達水平顯著降低（P＜ 0.05）。然而對PKD1過表達的細胞給予EA藥物處理后，PKD1能顯著恢復EA藥物處理對MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路中關鍵蛋白表達水平的影響。實驗結(jié)果證實了EA可能通過調(diào)控PKD1介導的MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路來影響乳腺細胞的增殖能力。

3 討論

雖然近年來在乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療中取得了重大進展，但是乳腺癌患者的5年生存率仍然較低?；谥兴幍闹嗅t(yī)治療在過去幾十年中已得到越來越多的應用，并因其在增強化療過程中的功效和降低毒性方面的重要作用而被關注，并且在多種癌癥的預防和治療方面具有一定作用[6-7]。據(jù)估計，美國國家癌癥研究所（NCI）每年在中醫(yī)相關研究項目上花費約1.2億美元[8]。乳腺癌患者的治療除了手術(shù)、放射療法、化學療法以外，還經(jīng)常將中藥治療視為一種治療方法[9]。

圖 2 PKD1 mRNA 和蛋白表達水平及對增殖的影響

圖 3 EA通過干擾PKD1介導的信號通路抑制細胞增殖的機制研究

EA是從中藥月腺大戟中提取的乙酰間苯三酚類化合物。在前期研究結(jié)果中證實EA可以抑制乳腺癌細胞的增殖能力。蛋白激酶D（PKD）是一個進化保守的蛋白激酶家族，具有不同PKC家族成員的結(jié)構(gòu)酶學和調(diào)控特性。PKD1是其中研究最多的家族成員。研究發(fā)現(xiàn)PKD1可以通過作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路調(diào)控乳腺癌細胞的增殖能力[5]。因此，在本研究中首先驗證了EA是否會影響PKD1的表達。結(jié)果顯示EA呈劑量依賴的方式抑制乳腺癌細胞中PKD1蛋白表達。為了進一步證實EA是否通過影響PKD1的表達來調(diào)控乳腺癌細胞的增殖能力，課題組體外構(gòu)建了PKD1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞。在證實轉(zhuǎn)染效率較高后，發(fā)現(xiàn)PKD1過表達能夠逆轉(zhuǎn)EA在mRNA和蛋白水平上對PKD1的抑制作用。同時，EA能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖能力，這與前期研究結(jié)果一致。然而，原本受EA干預而降低的細胞增殖能力在PKD1過表達的情況下被顯著逆轉(zhuǎn)，證實PKD1能逆轉(zhuǎn)EA對乳腺癌細胞的增殖抑制作用。

最后，課題組對EA如何通過干擾PKD1影響乳腺癌細胞增殖能力的機制進一步研究。既往的研究已經(jīng)證明PKD1可以通過作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路調(diào)控乳腺癌細胞的增殖能力[10]。因此，我們分析了MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路中關鍵蛋白的變化。實驗結(jié)果證實EA藥物作用于乳腺癌細胞時p-ERK1/2、p-AKT表達水平顯著降低，說明EA能抑制MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路活性。但是，當EA藥物和PKD1過表達同時處理時，PKD1過表達能顯著恢復EA對p-ERK1/2、p-AKT的抑制作用。實驗結(jié)果證實EA可能通過干擾PKD1介導MAPK和PI3K/AKT信號通路活性，從而抑制了乳腺癌細胞增殖。

此外，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復雜的過程，本研究證實PKD1能顯著促進乳腺癌細胞的增殖能力，這與已有的文獻報道中PKD1會促進乳腺癌細胞增殖能力的結(jié)果是吻合的。但是在其他文獻中報道過表達PKD1會顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲過程[11]。也就是說在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲前，腫瘤細胞大量增殖的階段可以通過藥物抑制PKD1的表達和活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖。因此，在乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲前，使用EA抑制PKD1的表達和活性，可能具有抑制乳腺癌細胞增殖的功能。但是，如果腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲后，藥物抑制PKD1的表達，可能會產(chǎn)生促進腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的結(jié)果，使得腫瘤疾病向更加惡化的方向發(fā)展。因此，EA在乳腺癌中的應用應該嚴格注意腫瘤病理狀態(tài)，在未發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的患者中EA可通過抑制PKD1發(fā)揮抗腫瘤作用，而在已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的患者中則應該謹慎使用調(diào)控PKD1的藥物。

綜上所述，經(jīng)過一系列研究證實EA以劑量依賴的方式抑制乳腺癌細胞中PKD1的表達，而PKD1過表達能恢復EA對乳腺癌細胞增殖能力的抑制作用。同時，EA可能通過干擾PKD1介導的MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路的活性抑制乳腺癌細胞的增殖能力?？傊狙芯渴状谓沂玖薊A藥物通過抑制PKD1的表達及其介導的MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抑制乳腺癌細胞的增殖作用。