HMS-01在大鼠體內的藥動學研究

張 宇，秦 臻，孫 旸，呂加國，吳 芳，劉 霞 （.海軍軍醫(yī)大學藥學院臨床藥學教研室，上海 00433；.西安秦申嘉合藥物研究有限公司，陜西 西安 70068）

疲勞的定義為機體生理過程不能維持其機能在一特定水平上，或不能維持預定的運動強度[1]。由于疲勞的分子機制并不清楚，目前并無真正官方認可的抗疲勞藥物。一些天然產物，如人參、紅景天、大蒜等，以及營養(yǎng)補充劑，如維生素、礦物質和肌酸等，報道有抵抗肌肉疲勞、提高運動成績的效應，但是效果緩慢而不顯著[2]；苯丙胺、莫達非尼、咖啡因等藥物雖能快速改善疲勞，但實質為中樞興奮藥，存在成癮、耐受、改變生物節(jié)律等問題[3]。因此，抗疲勞藥物的進一步研發(fā)，對改善生活質量、提升運動成績、提高軍事作業(yè)能力有重要意義。

組織糖原含量與疲勞的發(fā)生密切相關[4]。本課題組通過大規(guī)?；衔锖铣珊秃Y選，獲得了一個全新小分子化合物HMS-01，可以通過促進肝臟和肌肉組織糖原的儲存，改善疲勞后組織損傷，顯著增加肌肉耐力，發(fā)揮抗疲勞的作用。為了進一步了解HMS-01的藥動學特點以及在組織中的分布，本課題組采用液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)技術[5-6]，研究建立靈敏、特異的測定血漿等生物樣品中HMS-01濃度的分析方法，并開展HMS-01在大鼠體內的藥動學研究，為后續(xù)藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ液相色譜儀（Agilent Technologies，美國）、4000 Q-Trap 型串聯(lián)質譜儀(AB Sciex，美國)；低溫高速離心機（Thermo，德國）；XW 80A型渦旋混合器（醫(yī)大儀器，上海）；Mettler AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；Millipore-Q超純去離子水凈化儀（Millipore，美國）。

1.2 試藥

HMS-01（西安秦申嘉合藥物研究有限公司，批號 HMS-1-1010-3）；羅紅霉素（Sigma，CAS：2058-46-0）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；甲酸（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；其他試劑為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Gemini C18(50 mm×2.0 mm, 5 μm)，流動相：含 5 mmol甲酸銨及 1 mmol甲酸的水溶液 (A)-含 1 mmol甲酸的乙腈 (B)，梯度洗脫，洗脫程序如下：0～2 min，90% A；2～6 min，5% A；6～8 min，90% A。流速：0.35 ml/min，柱溫：25 ℃，進樣量 5μl，運行時間 8 min。

2.2 質譜條件

采用ESI正離子模式，多反應離子監(jiān)測模式(MRM)進行二級掃描；動態(tài)反應監(jiān)測的離子對參數(shù)：HMS-01 772.5→614.5；羅紅霉素（IS）837.5→158.1。離子源參數(shù)設置：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速 10 L/min；霧化器壓力 40 psi；鞘氣溫度 400 ℃；鞘氣流速 11 L/min；毛細管電壓 4 000 V；噴嘴電壓500 V。HMS-01 保留時間為 2.834 min，羅紅霉素保留時間為2.839 min，色譜圖如圖1所示。

2.3 標準曲線溶液的配制和質控樣品的制備

精密稱取 HMS-01 對照品 772.5 mg，置于 10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為77.25 mg/ml對照品儲備液。再采用逐級稀釋法配置質量濃度為 772.5、386.25、193.125、96.563、 48.281、 24.141、 12.070、 6.035、 3.018、1.509、0.754 ng/ml的系列含對照品血漿溶液；隨行質控樣品中HMS-01的低、中、高質量濃度分別為 3.09、30.9、618 ng/ml。以上溶液置于 4 ℃ 冰箱備用。

2.4 血漿樣品前處理方法

取 50 μl血漿樣品于離心管中，加入 200 μl（含41.875 ng/ml的 IS 內標）乙腈溶液，渦旋 60 s，4 ℃條件下 3 000×g離心 10 min，取上清液進樣。

2.5 線性關系考察

按“2.3”項和“2.4”項中的方法制備標準曲線，平行操作5份，按上述LC-MS/MS條件，連續(xù)進樣分析，以對照品濃度(X)為橫坐標，HMS-01的峰面積與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程：

線性范圍為 0.976～1 000 ng/ml，以信噪比為3或5時測得HMS-01的最低定量限均為976 pg/ml。

2.6 精密度試驗

按“2.3”項和“2.4”項中的方法制備低、中、高3種濃度的質控樣品，平行操作5份，連續(xù)3 d，計算實測濃度。如表1所示，精密度用相對標準偏差(RSD)表示，結果日內精密度RSD≤12%，日間精密度RSD≤9%；準確度以相對回收率表示，實測濃度與理論加入濃度的比值即為相對回收率。結果表明日內、日間結果準確度范圍在87%～106%。

2.7 基質效應和提取回收率

按“2.3”項和“2.4”項中的方法制備低、高2種濃度含藥血漿，平行操作6份；取空白血漿按“2.4”項下處理，甲醇代替內標溶液，取處理好的空白血漿樣品加入相應濃度對照品溶液，使之濃度與待測物的峰面積理論濃度一致，分別制備6份；將待測化合物標準溶液用甲醇稀釋，使之與待測物的峰面積理論濃度一致，進樣6次?；|效應等于（含基質樣品的峰面積）/（80%乙腈溶液的峰面積），提取回收率等于（待測物的峰面積）/（含基質樣品的峰面積），考察內標的基質效應和提取回收率操作步驟同上。低、高兩種濃度待測物及內標提取回收率均在 60%～75%之間，基質效應均在 5.6%～6.1%之間，具體結果見表2。

2.8 穩(wěn)定性試驗

圖 1 典型質量色譜圖

按“2.3”項和“2.4”項中的方法制備低、高2種濃度含藥血漿，分別考察樣品前處理后室溫放置24 h，3 次凍融循環(huán)以及-70 ℃ 保存 30 d 的穩(wěn)定性，測定樣品濃度，計算平均值，并計算RSD(%)及相對偏差RE(%)，計算公式：RE%=（實測值-真實值）/真實值×100%。結果見表3。測定結果的RE范圍為2%～17%，RSD均小于7%，表明樣本穩(wěn)定性良好。

表 1 HMS-01 在大鼠血漿中的精密度和準確度 (n=5)

表 2 待測物基質效應和提取回收率 (n=6)

表 3 樣品穩(wěn)定性 (n =3)

2.9 HMS-01 藥動學研究

SD大鼠12只，分成2組，每組6只，雌雄各半。給藥前禁食 12 h，自由飲水。按 30 mg/kg的劑量單次灌胃、1 mg /kg的劑量單次靜注給藥。灌胃給藥的，于給藥前和給藥后 5、10、20、30 min 和1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h分別眼眶采血約100 μl；靜注給藥的，于給藥前和給藥后 3、8、15、30 min和 1、2、3、4、6、8、10、12、24 h分別眼眶采血約 100 μl。血液用 1% 肝素抗凝，8 000×g離心5 min，分離血漿。-70 ℃保存待測。采血過程冰浴避光，以防止光對藥物穩(wěn)定性產生影響。

大鼠單次靜注給予1 mg/kg HMS-01后的藥動學參數(shù)（非房室模型）總結于表4。大鼠靜脈注射1 mg/kg HMS-01 后，雄、雌大鼠藥動學參數(shù)血漿濃度-時間曲線下面積（AUC）、平均清除率（CL）顯示有極顯著性差異（P＜0.01），藥動學參數(shù)血漿消除半衰期（t1/2）、表觀分布容積（V）均呈顯著性差異（P＜0.05）。雄性大鼠 AUC0-t為 221 ng·h/ml，CL為4.53 L/h·kg，為大鼠肝臟血流量（約 3.3 L/h·kg）的 137%，體內清除快，t1/2約為 0.786 h，V為5.13 L/kg；雌性大鼠 AUC0-t為 409 ng·h/ml，CL為2.41 L/h·kg，為大鼠肝臟血流量的 73%，體內清除較快，t1/2約為 1.27 h，V為 3.82 L/kg。

大鼠單次灌胃給予 30 mg/kg HMS-01后的藥動學參數(shù)（非房室模型）總結見表5。灌胃給予30 mg/kg HMS-01 后，雄、雌大鼠藥動學參數(shù) AUC顯示有極顯著性差異（P＜0.01），藥動學參數(shù)CL、F顯示有顯著性差異（P＜0.05）。在大鼠體內血漿濃度達峰時間tmax為 1.17 h，達峰濃度cmax為1 243 ng/ml，消除半衰期t1/2為 2.00 h。雄、雌大鼠AUC0-t分別為 2 271 和 8 529 ng·h/ml，生物利用度分別為34.3%和69.5%。

表 4 大鼠靜注 1 mg/kg HMS-01 后血漿藥動學參數(shù) (±s，n=6)

表 4 大鼠靜注 1 mg/kg HMS-01 后血漿藥動學參數(shù) (±s，n=6)

性別 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml) MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) CLz (L/h·kg) Vz (L/kg) cmax (ng/ml)雄性 221±12.6 221±12.4 0.776±0.022 0.786±0.039 4.53±0.252 5.13±0.388 491±112雌性 409±23.3** 416±21.0** 1.270±0.115 1.090±0.141* 2.41±0.120** 3.82±0.666* 571±55.1合計 315±105 319±108 1.030±0.282 0.940±0.193 3.47±1.17 4.47±0.871 531±90.3

表 5 大鼠灌胃 30 mg/kg HMS-01 后血漿藥代動力學參數(shù) (±s，n=6)

表 5 大鼠灌胃 30 mg/kg HMS-01 后血漿藥代動力學參數(shù) (±s，n=6)

性別 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml)images/BZ_54_848_2975_848_2977.png MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) tmax (t/h) CLz/F (L/h·kg) Vz/F (L/kg)cmax (ng/ml) F（%）雄性 2 271±666 2 279±667 2.58±0.156 1.43±0.130 1.17±0.289 14.00±4.31 28.5±7.04 729±263 34.3±10.1雌性 8 529±1 920** 9 071±1 529** 4.79±1.39 2.58±1.060 1.17±0.289 3.38±0.629* 13.1±7.78 1757±584 69.5±15.6*合計 5 400±3 661 5 675±3 867 3.68±1.50 2.00±0.924 1.17±0.258 8.69±6.44 20.8±10.7 1 243±694 51.9±22.6

3 討論

HMS-01在大鼠體內的藥動學過程存在顯著的性別差異?？诜盏谋容^，雌性大鼠的生物利用度遠高于雄性，體內的清除速率方面，雌性比雄性慢，與此同時，HMS-01在雌性體內的半衰期也更長。存在性別差異的原因有待進一步深入研究。本實驗采用的分析方法的特異性、靈敏性、準確性、精密度及穩(wěn)定性均滿足定量分析的要求。鑒于HMS-01在大鼠血漿中不穩(wěn)定的情況，在做動物實驗時，課題組將采取以下措施：全血采集后立刻在 4 ℃ 下離心 2 min 獲取血漿，隨即立刻取 50 μl血漿樣品加入至200 μl含內標的乙腈中，從而阻斷血漿中的水解酶對化合物進行水解。