藥物體外干預改善鹽敏感性高血壓小鼠內皮祖細胞功能研究

尚劉文心，孫 昕，彭 程，謝和輝，陳豐原，張 川 （.海軍軍醫(yī)大學藥學院中藥鑒定教研室，上海00433；.上海交通大學醫(yī)學院，上海 0005）

保護血管內皮對維護心血管系統(tǒng)健康有著重要意義[1]。近年的研究證實，血管內皮完整性的維持不僅依賴于現(xiàn)有的內皮細胞，而且與骨髓來源的具有向成熟內皮細胞分化能力的未成熟細胞—

內皮祖細胞 (endothelial progenitor cell, EPC)的募集有關[2-3]。臨床研究證實，外周血中循環(huán)EPC的數(shù)量與冠心病常見的危險因素（如高血壓、糖尿病等）呈負相關關系，EPC可作為治療缺血、肺動脈高壓等血管疾病狀態(tài)的新靶點[2-3]。本課題組和他人的研究均證實[2,4-5]，高血壓動物和患者的EPC均出現(xiàn)顯著的功能受損。因此，如果能夠通過藥物干預手段逆轉其受損的EPC功能，無疑對減輕高血壓患者與內皮功能相關的靶器官損傷，以及改善高血壓EPC移植治療效果等具有重要意義。

去氧皮質酮/鹽 (Deoxycorticosterone acetatesalt, DOCA-salt)高血壓模型是一種鹽敏感性高血壓動物模型，鹽敏感性高血壓在美國高血壓患者中占1/3的比例，是一種重要的高血壓類型[4-6]。課題組既往的研究證實，DOCA-salt高血壓小鼠EPC功能受損與其內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的脫偶聯(lián) (uncoupling)有關[5]。在研究中我們也找到了一些對eNOS脫偶聯(lián)相關的信號通路/分子有一定改善作用的藥物，如四氫生物蝶呤 (tetrahydrobiopterin, BH4)，超氧化物歧化酶-聚乙二醇 (superoxide dismutase-polyethylene glycol, PEG-SOD)，N(G)-硝基-L-精氨酸(N(G)-nitro-L-arginine, L-NNA)等[5-6]。但目前尚不知道這些藥物是否可有效逆轉DOCA-salt小鼠受損的EPC功能。本研究擬在以往研究的基礎上，尋找改善鹽敏感性高血壓小鼠EPC功能失常的有效藥物干預手段，為進一步的EPC移植治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型 (C57BL/6)雄性小鼠，10～12周齡，體重 20～25 g（上海斯萊克實驗動物中心）。

1.2 藥品及主要試劑

BH4、PEG-SOD、L-NNA（美國 Sigma公司），EGM-2培養(yǎng)基（Lonza公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），Matrigel膠（美國BD公司）。

1.3 小鼠模型的制備與實驗方法

1.3.1 DOCA-salt高血壓小鼠模型制備[5-6]

選用10～12周齡，體重20～25 g野生型(C57BL/6)雄性小鼠進行模型制作。小鼠麻醉，側臥位固定，腹部縱行切口，暴露左腎，小心結扎腎動脈和腎靜脈后，進行左腎切除，縫合切口。然后在小鼠兩前臂中間的位置開一個大約1 cm的縱行切口，皮下埋置150 mg/kg的DOCA緩釋片。DOCA組小鼠給予含1.0% NaCl和0.2% KCl的鹽水。假手術組小鼠也進行左腎切除，但不給DOCA緩釋片，而且飲用常規(guī)自來水。手術后，所有動物被單獨飼養(yǎng)于一個干凈的塑料籠內。術后第21天用尾動脈測壓法測定動物的收縮壓水平。

1.3.2 EPC 的分離與培養(yǎng)[4-5,7]

將玻璃粘連蛋白（vitronectin）加入6孔板預處理后備用。小鼠麻醉后處死。使用無菌器械剝離小鼠雙側后肢股骨、脛骨并剔除肌肉組織，于超凈臺內用EGM-2培養(yǎng)基沖出骨髓。將骨髓細胞濃度調定至2.5×105/cm2后，加入預處理的6孔板內培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2）。第 4 天棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，第7天使用。

1.3.3 EPC 的鑒定[5,7]

本研究采用了以下兩種鑒定方法。

（1）流式細胞儀法：EPC培養(yǎng)至第7天后，用0.125%胰酶-0.02% EDTA消化，洗滌后調整細胞密度為 2×106/ml，將細胞與 Sca-1 的抗體（1 μg/ml）和 Flk-1 的抗體（1 μg/ml）在冰上共孵育 1 h，注意避光。之后用5%BSA/PBS洗滌，再用2%的多聚甲醛固定10 min，用流式細胞儀檢測Sca-1、Flk-1雙標陽性的細胞，即為EPC。

（2）熒光顯微鏡法：EPC培養(yǎng)至第7天后，用PBS 洗細胞，加入 1 mg/ml Dil-acLDL(1:200)，于37 ℃避光孵育4 h，用PBS洗細胞，加2%多聚甲醛固定 10 min。加 10 μg/ml的 Lectin，室溫避光孵育1 h，再用PBS 洗細胞。加Hoechst 33258(10 μg/ml），室溫避光孵育30 min，用PBS洗細胞，加2%多聚甲醛固定10 min后，在熒光顯微鏡下觀察DilacLDL(紅色熒光）、Lectin（綠色熒光）、Hoechst 33258（藍色熒光）3種染料染色陽性的細胞，即為EPC。

1.3.4 EPC 的藥物干預[5]

小鼠骨髓來源EPC培養(yǎng)至第6天后換液，分別用 BH4(10 μmol/L), PEG-SOD (100 U/L)和 LNNA (0.8 mmol/L)3 種藥物孵育 24 h 后，測定其小管形成功能和黏附功能。

1.3.5 EPC 黏附功能的測定[4-5,7]

培養(yǎng)7 d的EPC用0.125%胰酶-0.02% EDTA消化，將 1×104細胞接種于vitronectin包被好的96孔板中，每個樣本設 4復孔。37 ℃、5% CO2孵育 24 h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌 3次，然后用Hoechst 33258 (5 μg/ml)染細胞核，再用 PBS 洗滌3次。在熒光顯微鏡下，隨機選取3個視野（100×）計算黏附細胞數(shù)并取平均值。

1.3.6 EPC 小管形成功能的測定[4-5,7]

在冰上預冷的 96孔板中加入 60 μl的matrigel，于 37 ℃ 孵育 30 min。培養(yǎng) 7 d 的 EPC用 0.125%胰酶-0.02% EDTA消化，將 5×104細胞接種于 matrigel上，在 37 ℃，5% CO2孵箱中孵育 6 h后，于顯微鏡下隨機選取4個視野（40×）計算形成小管的數(shù)目并取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

所得實驗數(shù)據(jù)均通過Prism統(tǒng)計軟件進行分析，分別選取配對t-檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)作為2組數(shù)據(jù)和3組以上數(shù)據(jù)之間比較的統(tǒng)計學分析方法；選用Newman Keuls法進行均數(shù)之間的多重比較。數(shù)據(jù)書寫格式為(均數(shù)±標準誤)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DOCA-salt高血壓小鼠的血壓水平

手術后分別測量高血壓模型組和假手術組動物的血壓水平，發(fā)現(xiàn)與假手術組相比，高血壓模型組動物的收縮壓水平顯著上升（P＜0.01，圖1）。

2.2 小鼠內皮祖細胞的鑒定

將培養(yǎng)至第7天的骨髓來源的EPC通過熒光顯微鏡法鑒定，顯示Dil-acLDL/Lectin/Hoechst 33258三染陽性的細胞的比例為87.18%；通過流式細胞儀法鑒定，顯示Sca-1和Flk-1雙標陽性的細胞比例為（11.2±1.5）:1，見圖2。以上結果與文獻報道中使用同類鑒定方法的結果相近[7-10]。

圖 1 假手術小鼠與 DOCA-salt高血壓小鼠收縮壓水平的比較(n=5)

圖 2 小鼠內皮祖細胞的鑒定

2.3 BH4, PEG-SOD, L-NNA孵育可顯著改善DOCA-salt高血壓小鼠EPC的黏附功能

與對照組相比，DOCA-salt高血壓小鼠EPC的黏附功能受損，而分別用 BH4(10 μmol/L), PEGSOD (100 U/L)，L-NNA (0.8 mmol/L)3 種藥物孵育24 h后，其黏附功能得到顯著改善（圖3）。

2.4 BH4, PEG-SOD, L-NNA孵育可顯著改善DOCA-salt高血壓小鼠EPC的小管形成功能

與對照組相比，DOCA-salt高血壓小鼠EPC的小管形成功能受損，而分別用 BH4(10 μmol/L),PEG-SOD (100 U/L)，L-NNA (0.8 mmol/L)3 種藥物孵育24 h后，其小管形成功能得到顯著改善（圖4）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，BH4、PEG-SOD和L-NNA均可有效改善DOCA-salt高血壓小鼠EPC受損的功能。但此3種藥物改善DOCA-salt小鼠EPC功能的具體機制尚有待進一步探究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，eNOS除了合成一氧化氮（nitric oxide, NO）外，在某些病理情況下，還是超氧陰離子（O2-）的重要來源。BH4是eNOS的必要輔助因子，影響 NO和 O2-的生成。BH4充足時eNOS催化底物L-精氨酸和O2-生成L-胍氨酸和NO；BH4缺乏時，eNOS則發(fā)生脫偶聯(lián)，主要催化O2-產生[5-6,11]。BH4缺乏是高血壓、糖尿病等疾病中內皮功能異常的重要原因[11]。

本課題組和他人曾利用DOCA-salt高血壓動物進行過大量血管生物學研究[4-6,12]，發(fā)現(xiàn)該動物血管功能異常與血管組織eNOS脫偶聯(lián)有關。另外首次發(fā)現(xiàn)，DOCA-salt高血壓小鼠EPC中BH4水平顯著下降，出現(xiàn)eNOS脫偶聯(lián)，而且eNOS脫偶聯(lián)所引起的O2-水平升高是導致EPC功能異常的重要機制之一[5]。接著，我們還嘗試采用一些藥物手段對eNOS脫偶聯(lián)相關的信號通路/分子進行了干預：①通過外源性補充BH4促進EPC的eNOS復偶聯(lián)；②用L-NNA抑制脫偶聯(lián)的eNOS活性，使其產生的O2-水平降低；③補充PEG-SOD直接清除EPC中升高的O2-[5]。我們發(fā)現(xiàn)，這些藥物干預手段都能顯著降低DOCA-salt高血壓小鼠EPC的O2-水平[5]。本研究在這些發(fā)現(xiàn)的基礎上進一步證實，這3種藥物干預手段也能顯著改善DOCA-salt高血壓小鼠EPC的黏附功能和小管形成功能。這些結果也反過來驗證了DOCA-salt小鼠EPC功能異常與eNOS脫偶聯(lián)的關系。

圖 3 BH4, PEG-SOD, L-NNA 孵育改善 DOCA-salt高血壓小鼠 EPC 的黏附功能

圖 4 BH4, PEG-SOD, L-NNA 孵育改善 DOCA-salt小鼠 EPC 的小管形成功能

通過本研究證實，BH4、PEG-SOD、L-NNA均可有效改善DOCA-salt高血壓小鼠EPC受損的功能。這些研究結果可為高血壓血管并發(fā)癥的治療提供參考，也可為改善高血壓EPC移植治療效果提供實驗基礎。