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    豆豉姜活性成分9,9’-O-二-(E)-阿魏?;?內(nèi)消旋-5,5’-二甲氧基開環(huán)異落葉松樹脂酚(LCA)抗炎作用研究

    2020-05-28 05:31:44余璐瑤孫曉蕾秦路平上海師范大學(xué)生命科學(xué)院上海0034海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室上海00433
    藥學(xué)實踐雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:美辛棉球肉芽腫

    余璐瑤,賈 丹,沈 慧,孫曉蕾,秦路平,,韓 婷 (.上海師范大學(xué)生命科學(xué)院,上海 0034;.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 00433)

    炎癥泛指機(jī)體受到創(chuàng)傷或病原體感染等刺激后所產(chǎn)生的生理反應(yīng),主要表現(xiàn)為疼痛、紅腫、發(fā)熱等[1]。通常情況下,機(jī)體受到創(chuàng)傷等刺激后,所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是一種生理性保護(hù)反應(yīng),有益于機(jī)體損傷的修復(fù)[2-3],但當(dāng)機(jī)體內(nèi)的抗炎系統(tǒng)過于活躍時,會引起自身免疫系統(tǒng)紊亂,對機(jī)體正常的細(xì)胞及組織進(jìn)行攻擊,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫疾病[4]。目前,臨床上常用的抗炎藥物主要分為甾體類抗炎藥(SAIDs)、非甾體類抗炎藥(NSAIDs)及免疫調(diào)節(jié)藥,但這幾類藥物多具有副作用[5-7],因此,新型抗炎藥物的研發(fā)具有極高的科研前景和社會價值。豆豉姜是樟科植物山雞椒Litsea cubeba(Lour.)Pers的根及根莖,被傣醫(yī)學(xué)及中醫(yī)作為廣泛的民間方劑,多用于祛風(fēng)散寒、息肝風(fēng)、消腫、治風(fēng)濕痹痛的治療。前期課題組提取分離得到新型的二芐基丁烷型木脂素9,9’-O-二-(E)-阿魏?;?內(nèi)消旋-5,5’-二甲氧基開環(huán)異落葉松樹脂酚(LCA)化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,并發(fā)現(xiàn)其具有改善類弗氏完全佐劑大鼠關(guān)節(jié)炎模型中炎性癥狀的療效[8],因此,課題組推測LCA是豆豉姜中具有抗炎活性的天然化合物,故采用小鼠耳腫脹和棉球肉芽腫模型及RAW264.7細(xì)胞實驗,對其抗炎作用進(jìn)行研究。

    圖 1 LCA 化學(xué)結(jié)構(gòu)

    1 材料

    1.1 實驗動物

    二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗?zāi)P停?周齡SPF 級雄性昆明小鼠,體重:(20±2)g;大鼠棉球肉芽腫實驗:4周齡 SPF級雄性 SD大鼠,體重:(120±10)g。動物由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,并飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動物房,室溫控制為 24 ℃,12 h 光照+12 h 黑暗,水及食物充足供應(yīng)。RAW264.7(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室)。

    1.2 試劑與器材

    LCA(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系有機(jī)化學(xué)教研室合成及鑒定);吲哚美辛(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院);二甲苯、水合氯醛、羧甲基纖維素鈉CMCNa、對氨基苯磺酸、磷酸、N-α-萘乙二胺(中國醫(yī)藥集團(tuán));棉球(中國朝陽公司);ELISA試劑盒(中國聯(lián)科公司);iNOS、COX-2、GAPDH抗體及二抗(CST,USA)。分析天平(MettlerToledo,USA);CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo,Japan);ELx 800 酶標(biāo)儀(Fisher,US);凝膠成像儀(Tanon-5200 multi,中國上海)。

    2 方法

    2.1 動物實驗

    2.1.1 動物模型建立及處理

    小鼠耳廓腫脹模型建立:將60只5周齡健康雄性昆明鼠安置于動物實驗中心適應(yīng)1周,按體重隨機(jī)分為4組,各10只,組別標(biāo)記為:模型組;LCA 組(20、40 mg/kg);吲哚美辛組(8 mg/kg)。給藥以灌胃的形式每日一次,模型組則予相同體積的 0.5% CMC-Na連續(xù) 3 d 灌胃,在末次給藥 1 h后,將二甲苯以0.05 ml/只劑量均勻涂布于小鼠右耳廓的雙面,左耳不做處理,連續(xù)刺激45 min后處死小鼠,用打孔器分別于左右耳廓同一位置打下圓形耳片[9],稱重,用于計算比較耳腫脹程度及耳腫脹抑制率(%)。

    大鼠棉球肉芽腫模型建立:將20只4周齡健康雄性SD大鼠安置于動物實驗中心適應(yīng)1周,按體重隨機(jī)分為 4 組:模型組;LCA 組(20、40 mg/kg);吲哚美辛組(5 mg/kg)。用水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉,于左右兩邊腋窩下切開一小口,將2個滅菌棉球(20 mg)分別植入小鼠左右腋窩,縫合后第2天給藥。且以灌胃的形式每日一次,模型組則予相同體積的 0.5% CMC-Na 連續(xù) 7 d[10-11]。第 8 天處死大鼠,將腋下棉球及附著的肉芽組織剝離,稱重,用于計算比較干濕重及抑制率。

    2.1.2 動物指標(biāo)測定

    耳腫脹度=右耳片重量-左耳片重量

    耳腫脹抑制率(%)=(模型組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/模型組平均耳腫脹度×100%

    平均棉球肉芽腫重量=(右側(cè)棉球肉芽腫重量+左側(cè)棉球肉芽腫重量)/2

    棉球肉芽腫抑制率(%)=(模型組平均棉球肉芽腫重量-給藥組平均棉球肉芽腫重量)/模型組平均棉球肉芽腫重量×100%

    2.2 RAW264.7 細(xì)胞實驗

    2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞)用DMEM高糖完全培養(yǎng)基(10% DMEM+90% FBS+1%雙抗)培養(yǎng)于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

    2.2.2 細(xì)胞增殖檢測

    將RAW264.7細(xì)胞以1×103個/孔接種于96孔板,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,棄上清液,給予不同濃度的 LCA 培養(yǎng)液(3、1.5、0.75和 0.375 μmol/L),并設(shè)置空白對照組,每組5個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h,采用MTT法測定LCA對小鼠單核巨噬細(xì)胞的增殖作用。

    2.2.3 炎癥因子水平測定

    將RAW264.7細(xì)胞以1×106個/孔接種于24孔板,24 h 后棄上清液,脂多糖(LPS)組和 LCA 組中加入 1 ml含 2 μg/ml LPS 的完全培養(yǎng)基,刺激 2 h,于空白組和LPS組中加入1 ml完全培養(yǎng)基,給藥組加入各濃度 LCA(1.5、0.75和 0.375 μmol/L)的完全培養(yǎng)基,作用 24 h 后,測 NO 含量:取 100 μl上清液與 100 μl Griess試劑(A 液:對氨基苯磺酸0.1 g,加 5% 磷酸 10ml;B 液:N-α-萘乙二胺 0.01 g,加10ml蒸餾水,等體積混合)混合避光顯色30 min,用酶標(biāo)儀于 540 nm處測各孔吸光度(A)值;測TNF-α:取上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟測量上清液中炎癥因子TNF-α的含量。

    2.2.4 炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

    將RAW264.7細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板,細(xì)胞貼壁后,處理組(LPS組、LCA組)中加入1ml含 2 μg/ml LPS 的完全培養(yǎng)基,刺激 2 h,于空白組和LPS組中加入1 ml完全培養(yǎng)基,給藥組加入各濃度 LCA(1.5、0.75和 0.375 μmol/L)的完全培養(yǎng)基,作用24 h后,細(xì)胞裂解提取蛋白并定量,蛋白變性后SDS-PAGE凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)膜,封閉,依次用 iNOS,COX-2及 GAPDH于 4 ℃孵育過夜,用洗膜液(TBST)清洗3次后,二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌后,用化學(xué)發(fā)光試劑盒于凝膠成像儀中顯影拍片。

    2.3 統(tǒng)計分析

    3 結(jié)果

    3.1 LCA 對小鼠耳腫脹的影響

    如表1所示,與模型組對比,吲哚美辛(8 mg/kg)可抑制由二甲苯造成的小鼠耳廓腫脹(P<0.05),抑制率為 29.80%;LCA(40 mg/kg)組顯著抑制小鼠耳廓腫脹度(P<0.01),抑制率為 37.41%,而 LCA(20 mg/kg)組對小鼠耳廓腫脹度的抑制無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    3.2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫的影響

    如圖2,模型組大鼠棉球肉芽腫體積較大且顏色鮮紅,吲哚美辛組的棉球肉芽腫體積小且顏色淺,而LCA組的棉球肉芽腫在色澤和大小上均有別于模型組。數(shù)據(jù)分析顯示(表2、表3),與模型組相比,陽性藥組吲哚美辛明顯抑制大鼠的棉球肉芽腫(P<0.001),且干重、濕重的抑制率分別為48.73%和44.19%;LCA高劑量組也可明顯減少棉球肉芽腫的干重及濕重(P<0.01),且抑制率達(dá)到23.89%和29.90%。

    表 1 LCA 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (n=10,±s)

    表 1 LCA 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 (n=10,±s)

    *P<0.05,**P<0.01,與模型組比較。

    組別 腫脹度(m/mg) 抑制率(%)模型組 3.02±0.63 —LCA組(20 mg/kg) 2.52±0.29 16.56 LCA組(40 mg/kg) 1.89±0.54** 37.41吲哚美辛組(8 mg/kg) 2.12±0.61* 29.80

    圖 2 各組大鼠棉球肉芽腫對比

    表 2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫濕重的影響 (n=5,±s)

    表 2 LCA 對大鼠棉球肉芽腫濕重的影響 (n=5,±s)

    ***P<0.001,與模型組比較。

    組別 棉球肉芽腫濕重(m/mg) 抑制率(%)模型組 300.1±53.26 —LCA組(20 mg/kg) 256.0±36.36 14.70 LCA組(40 mg/kg) 228.4±51.16*** 23.89吲哚美辛組(5 mg/kg) 167.5±15.74*** 44.19

    表 3 LCA 對大鼠棉球肉芽腫干重的影響 (n=5,±s)

    表 3 LCA 對大鼠棉球肉芽腫干重的影響 (n=5,±s)

    **P<0.01,***P<0.001,與模型組比較。

    組別 棉球肉芽腫干重(m/mg) 抑制率(%)模型組 48.1±10.05 —LCA組(20 mg/kg) 42.32±10.19 12.05 LCA組(40 mg/kg) 33.73±7.10** 29.90吲哚美辛組(5 mg/kg) 24.67±7.39*** 48.73

    3.3 LCA對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

    如圖3所示,LCA的安全劑量不高于3 μmol/ml,且在0.75和1.5 μmol/ml濃度下顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的NO和TNF-α濃度,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

    3.4 LCA 對炎癥相關(guān)的蛋白表達(dá)的影響

    如圖4所示,LCA在1.5 μmol/ml濃度下顯著抑制了炎癥相關(guān)蛋白iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)(P<0.001)。

    4 討論

    據(jù)報道[12],許多從中藥中提取的活性天然化合物可以達(dá)到抗炎效果,包括黃芩苷、青藤堿和大黃素等,多為甘草次酸酰胺類衍生物。LCA不同于這些抗炎藥物,它具有新穎的二芐基丁烷型結(jié)構(gòu),本研究從體內(nèi)、體外兩方面對它進(jìn)行較為系統(tǒng)的抗炎藥效評價。

    圖 3 LCA對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞增殖、NO和TNF-α分泌量的影響(n=5,±s)

    圖 4 LCA 對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 (n=3,±s)

    二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型是評價藥物體內(nèi)抗炎活性的急性炎癥模型之一[13],本實驗?zāi)P徒M中二甲苯作為致炎劑刺激小鼠耳廓皮膚,促進(jìn)血管舒張、增加血管通透性致使炎性物質(zhì)滲出,耳片重量明顯高于未經(jīng)處理的耳片重量,LCA組能明顯改善小鼠耳部的炎性滲出及腫脹程度,且高濃度組的抑制率高于陽性藥吲哚美辛組(由于吲哚美辛高濃度有強烈的胃腸道反應(yīng),故根據(jù)臨床用藥劑量換算出實驗動物的劑量,并參考相關(guān)文獻(xiàn)確定用藥量[13],即8 mg/kg),表明LCA對急性炎癥有顯著作用。在慢性炎癥期,由于巨噬細(xì)胞和纖維母細(xì)胞等增生而形成肉芽組織,棉球肉芽腫實驗可模擬炎癥病理過程中炎性細(xì)胞浸潤和肉芽組織的增生[14]。結(jié)果顯示LCA降低棉球肉芽腫的濕重與干重,表明LCA可以控制慢性炎癥過程中炎性滲出物的轉(zhuǎn)移,同時抑制棉球外側(cè)小血管和結(jié)締組織的增生,證明LCA可以減少慢性炎癥進(jìn)程中肉芽組織的形成。結(jié)合上述兩個動物實驗可知LCA對急性炎癥以及慢性炎癥都具有一定的抑制作用。

    炎癥的普遍特征是病灶區(qū)域有大量炎癥細(xì)胞的浸潤,并釋放大量炎癥因子和介質(zhì),如IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素(PG)、組織胺和 NO等。其中,NO可激活NF-κB信號通路,誘導(dǎo)促炎因子(IL-6、TNF-α等)的分泌,引起機(jī)體組織損傷以及血管擴(kuò)張;TNF-α可刺激細(xì)胞免疫中T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的加重和擴(kuò)大。iNOS可介導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO并參與炎癥反應(yīng);COX-2介導(dǎo)產(chǎn)生的前列腺素與慢性炎癥的發(fā)展和持續(xù)有關(guān),致使白細(xì)胞聚集和浸潤,引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在本研究中,LPS刺激后,RAW264.7細(xì)胞分泌的NO和TNF-α含量,以及細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白水平明顯增高,LCA濃度為1.5 μmol/ml時顯著抑制激活狀態(tài)下NO和TNF-α炎癥介質(zhì)的分泌,同時下調(diào)iNOS及COX-2蛋白的表達(dá)水平。由此進(jìn)一步證實LCA具有抗炎作用。然而,LCA抗炎的具體作用機(jī)制尚不明確,有待今后進(jìn)行更深層次的研究探討。

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