重組人白血病抑制因子蛋白對兔椎間盤退變模型髓核細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制Δ

穆 林，房 昕，龔 箭，高迎慶，周 強(qiáng)（.鐵嶺市中心醫(yī)院骨科一病房，遼寧 鐵嶺 000； .中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，重慶 40003）

腰椎為臨床椎間盤退變性疾病的常見部位［1］。 正常椎間盤由中央部的髓核組織和周圍部的纖維環(huán)組成，髓核組織又由退變髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cells，NPCs）及其周圍蛋白多糖黏液樣細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）構(gòu)成。 近年來研究結(jié)果顯示，NPCs 凋亡與椎間盤進(jìn)行性退變存在關(guān)聯(lián)［2］。 重組人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）因可抑制小鼠M1 白血病細(xì)胞增殖而得名，在活化T 細(xì)胞、單核細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞等中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)［3］。 研究結(jié)果顯示，LIF 可參與調(diào)控特定細(xì)胞的增殖分化、骨代謝和炎癥反應(yīng)等活動［4］。 本研究采用針刺法構(gòu)建兔椎間盤退變模型，探討了重組人LIF 蛋白對退變NPCs 凋亡的影響機(jī)制，旨在為臨床椎間盤退變性疾病的治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 動物

實驗用新西蘭大白兔購自上海甲干生物科技有限公司，40 只，雄性20 只，雌性20 只，平均月齡（3.36±1.23）個月，平均體質(zhì)量（2.51±1.12） kg，12 h／12 h 晝夜交替適應(yīng)性喂養(yǎng)，充足水和食物。

1.2 主要試劑和儀器

重組人LIF（美國eBioscience 公司）。 總蛋白提取試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號P1250）；Annexin V-FITC／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，貨號BB-4101）。 LIF 兔抗人單克隆抗體、ERK1／2 鼠抗人單克隆抗體、p-ERK1／2 鼠抗人單克隆抗體、JNK 鼠抗人單克隆抗體、p-JNK 鼠抗人單克隆抗體、p83 鼠抗人單克隆抗體及p-p83 鼠抗人單克隆抗體均購自美國Abcam 公司；蛋白聚糖（Aggrecan）鼠抗人單克隆抗體、Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體均購自美國Cell signaling technology 公司；GADPH 鼠抗人單克隆抗體（碧云天生物科技有限公司）。 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；1.5T磁共振儀（德國西門子公司）。

1.3 兔椎間盤退變模型構(gòu)建及評價

采用針刺法，具體步驟如下：將實驗用新西蘭大白兔隨機(jī)分為模型組和對照組，每組20 只。 模型組兔采用針刺法［5］經(jīng)L4—5節(jié)段椎間盤側(cè)方倒八字入路，利用18G 針頭由纖維環(huán)刺入髓核中心，明顯落空感后旋轉(zhuǎn)針頭3 圈，停留5 s 后拔出，0.9%氯化鈉溶液沖洗手術(shù)部位，縫合切口。 對照組兔操作部位和方法同模型組，但不進(jìn)行針刺操作。 術(shù)后兩組兔均給予青霉素8 萬U，腹內(nèi)注射。 術(shù)后行磁共振成像檢查，分別測量手術(shù)部位最高點、椎體前后緣椎間盤高度，取平均值，利用Image J 軟件分析各組椎間盤髓核組織5 個層面平均信號強(qiáng)度與背景噪聲，計算信號-噪聲比（SNR）。

1.4 標(biāo)本收集及處理

髓核組織：取模型組和對照組兔相應(yīng)手術(shù)節(jié)段椎間盤髓核組織，裁剪為1 mm×1 mm×1 mm 標(biāo)本，制作組織切片。 退變NPCs 分離：取模型組兔相應(yīng)手術(shù)節(jié)段椎間盤髓核組織，采用Ⅱ型膠原酶消化法和組織塊貼壁法［6］分離培養(yǎng)模型組兔的NPCs，取P3 代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，生長融合度達(dá)80%左右分別加入0、10、20、50 及100 ng／ml 重組人LIF 處理72 h。

1.5 Western Blot 法檢測蛋白表達(dá)水平

利用總蛋白提取試劑盒提取髓核組織和不同濃度重組人LIF 因子處理退變NPCs 總蛋白；采用BCA 法檢測髓核組織LIF蛋白濃度、退變NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型膠原濃度和退變NPCs 中JNK、p38、ERK1／2、p-JNK、p-p38 及p-ERK1／2 濃度。

1.6 Annexin V-FITC／PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-FITC／PI 雙染法檢測退變NPCs 凋亡，按照試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞術(shù)觀察凋亡情況，以Annexin V 為橫軸，PI 為縱軸，左上為機(jī)械性損傷細(xì)胞，右上為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，左下為正常細(xì)胞，右下為早期凋亡細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組椎間盤高度和SNR 比較

模型組兔的平均椎間盤高度為（76.21±4.23） mm，明顯低于對照組的（102.12±5.38） mm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組兔的SNR 為18.56±2.13，明顯低于對照組的42.56±1.97，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 髓核組織LIF 蛋白表達(dá)

Western Blot 實驗結(jié)果顯示，模型組兔髓核組織中LIF 蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；針刺2周、4 周及8 周兔髓核組織中LIF 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 重組人LIF 蛋白對退變NPCs 凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重組人LIF蛋白處理退變NPCs 凋亡率分別為（47.98±1.35）%、（43.65±1.42）%、（41.12 ± 1.38）%、 （38.14 ± 1.36）% 及（36.52 ±1.34）%；0、10、20、50 及100 ng／ml 重組人LIF 蛋白處理的退變NPCs 凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 重組人LIF 蛋白對退變NPCs 細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響

Western Blot 實驗結(jié)果顯示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重組人LIF 蛋白處理的退變NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型膠原表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.5 重組人LIF 蛋白對MAPK-ERK1／2 通路的影響

圖1 髓核組織LIF 蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of LIF protein in nucleus pulposus

圖2 重組人LIF 蛋白對退變NPCs 細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響Fig 2 Effects of recombinant human LIF protein on extracellular matrix expression of degenerated NPCs

Western Blot 實驗結(jié)果顯示，0、10、20、50 及100 ng／ml 重組人LIF 蛋白處理的退變NPCs 中p-ERK1／2 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

3 討論

腰椎間盤退行性病變?yōu)楣强瞥Ｒ娂膊?，以腰痛、下肢疼痛麻木為主要臨床表現(xiàn)［7］。 腰椎間盤退行性病變病因尚未明確，大多認(rèn)為與腰椎間盤纖維環(huán)、髓核和軟骨終板退變有關(guān)［8］。 兔NPCs 的結(jié)構(gòu)和成分與人類較為相似且有較好經(jīng)濟(jì)性和可重復(fù)性，為臨床常用椎間盤退變模型［9］。 本研究采用針刺法構(gòu)建了兔椎間盤退變模型，結(jié)果顯示，模型組椎間盤高度和SNR 均顯著低于對照組，提示模型構(gòu)建成功［10］。

圖3 重組人LIF 蛋白對MAPK-ERK1／2 通路的影響Fig 3 Effects of recombinant human LIF protein on MAPK-ERK1／2 pathway

LIF 最早被發(fā)現(xiàn)于鼠類M1 型白血病，因可抑制小鼠M1白血病細(xì)胞增殖而得名。 近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIF 為具有生物多樣性活性的分子，在很多病理生理過程中起著重要作用［11］。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組兔髓核組織中LIF 蛋白表達(dá)水平高于對照組，隨針刺時間延長而降低，提示兔椎間盤退變髓核組織中LIF 蛋白呈高表達(dá)，且隨退變程度上升。 黃艷等［12］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIF 可作用于異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)血管生成因子分泌，參與疾病發(fā)生和進(jìn)展。 Hunt 等［13］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIF 可與LIF 受體結(jié)合調(diào)控肌肉細(xì)胞生長、肌源性分化、運動反應(yīng)、代謝、神經(jīng)支配和炎癥細(xì)胞向肌肉損傷部位募集。 本研究結(jié)果顯示，退變NPCs 凋亡率隨重組人LIF 蛋白處理濃度增加而升高，提示LIF 高表達(dá)可抑制退變NPCs 凋亡，且隨其表達(dá)水平升高抑制作用越明顯。 椎間盤退變早期多表現(xiàn)為髓核脫水、纖維環(huán)撕裂和軟骨終板形成裂隙［14］。 隨著疾病進(jìn)展可發(fā)展為軟骨終板骨化、椎體終板物質(zhì)交換通道變窄，導(dǎo)致大量酸性物質(zhì)和基質(zhì)降解產(chǎn)物堆積在椎間盤內(nèi)堵塞交換通道，加重纖維環(huán)退變，最終引起纖維環(huán)髓核脫出［15］。髓核由軟骨樣NPCs 及其周圍ECM 構(gòu)成。 近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NPCs 代謝及ECM 分泌與椎間盤退變發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)［16］。 有文獻(xiàn)報道，細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化可破壞椎間盤細(xì)胞生存內(nèi)環(huán)境，使椎間盤發(fā)生退變［17］。 Aggtecan 蛋白和Ⅱ型膠原為ECM 重要組成成分，可有效緩沖加載于椎體的應(yīng)力和維持椎間盤正常高度［2］。 本研究結(jié)果顯示，退變NPCs 中Aggtecan 蛋白和Ⅱ型膠原表達(dá)水平隨重組人LIF 蛋白處理濃度增加而升高，提示LIF 蛋白可促進(jìn)退變的NPCs 合成ECM成分，抑制椎間盤退變。 絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK）信號通路真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡和死亡等生理過程具有重要意義［18］。 其中，ERK、JNK 和p38 為MAPK 信號通路主要亞群［19］。 有文獻(xiàn)報道，MAPK 信號通路參與膝關(guān)節(jié)軟骨退變過程［20］。 本研究利用不同濃度重組人LIF 蛋白處理退變NPCs 發(fā)現(xiàn)，重組人LIF 蛋白對p-JNK、p-p38 無明顯作用，而p-ERK1／2 蛋白表達(dá)水平隨重組人LIF 蛋白處理濃度增加而升高，提示LIF 可通過促進(jìn)ERK1／2 蛋白磷酸化激活ERK1／2 通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成達(dá)到抑制NPCs 凋亡作用；在椎間盤內(nèi)注射重組LIF 因子有可能通過抑制NPCs 凋亡延緩椎間盤退變的進(jìn)展。

綜上所述，兔椎間盤退變髓核組織中LIF 蛋白呈高表達(dá)，其可能通過激活ERK1／2 通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成達(dá)到抑制NPCs 凋亡作用，重組LIF 對延緩椎間盤退變進(jìn)展顯示出了良好前景。