不同貯存時(shí)間對(duì)酸橙枳實(shí)藥材的質(zhì)量影響Δ

徐俊達(dá)，張 涵，石敬依，蔡文君，羅 容#（.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 00069； .天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 3067）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck 的干燥幼果［1］，是傳統(tǒng)的“六陳”中藥之一。 所謂“陳藥”是指這些藥物陳久放置后入藥，藥效更佳或毒性更低。 南北朝梁代《本草經(jīng)集注》中記載6 味中藥需陳用，“凡狼毒、枳實(shí)、橘皮、半夏、麻黃、吳茱萸，皆欲得陳久者良，其余須精新也”，說明上述6 味藥通過陳化后更能滿足臨床用藥需要［2-3］。 此后，《新修本草》、李東垣《珍珠囊指掌補(bǔ)遺藥性賦》及張從正《儒門事親》等文獻(xiàn)中記載的陳藥均有枳實(shí)。

如何界定中藥陳化時(shí)限一直是陳藥研究中的一個(gè)難點(diǎn)。歷代本草或方書眾說不一，有1 年、2 年、3 年甚至數(shù)十年者，也有“陳年”“多年”“年久”和“陳久”等不能明確具體時(shí)間的說法；即使同一種藥物，陳化時(shí)間亦有不同［2］。 此外，枳實(shí)的陳久存放是否會(huì)對(duì)其已明確的除揮發(fā)油外的其他藥效組分產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響還未見報(bào)道。

枳實(shí)藥材主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類和香豆素類等成分［4-6］。 辛弗林是《中華人民共和國藥典》（2015 年版）中枳實(shí)的定量質(zhì)控成分，通常被認(rèn)為是枳實(shí)的特征成分。 黃酮類化合物是枳實(shí)的主要有效成分［6-7］。 本研究結(jié)合本草論述和現(xiàn)代藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果，以酸橙枳實(shí)為研究對(duì)象，以辛弗林、新橙皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、川陳皮素、橙皮苷和蕓香柚皮苷含量為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立同時(shí)測(cè)定新橙皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、川陳皮素、橙皮苷和蕓香柚皮苷的超高效液相 色 譜 法（ ultra-high performance liquid chromatography，UPLC），初步比較不同貯存時(shí)間對(duì)枳實(shí)藥效組分的影響，以期為枳實(shí)陳用提供科學(xué)依據(jù)，為枳實(shí)陳化時(shí)限提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；WATERS ACQUITY UPC2 型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；WG-43 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；YP601N 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DFT-150 型手提式高速中藥粉碎機(jī)（上海左樂儀器有限公司）；KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：辛弗林，批號(hào)110727-0036；新橙皮苷，批號(hào)111857-201102；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號(hào)110722-201312；野漆樹苷，批號(hào)111919-201102；橙皮苷，批號(hào)：110721-201014；酸橙枳實(shí)對(duì)照藥材，批號(hào)1120936-201005；以上對(duì)照品及對(duì)照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。 川陳皮素，批號(hào)MUST-13041206，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院和北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制；蕓香柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號(hào)14259-46-2，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院生產(chǎn)。 色譜級(jí)乙腈（批號(hào)181005，F(xiàn)isher Chemical 公司）；色譜級(jí)甲醇（批號(hào)181102，F(xiàn)isher Chemical 公司）；乙酸（批號(hào)20150807，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 枳實(shí)樣品

枳實(shí)藥材除7 號(hào)樣品外，均購于中藥材市場。 所有樣品均為新貨，見表1。 枳實(shí)藥材每年5—6 月產(chǎn)新，新貨進(jìn)入市場一般為當(dāng)年6 月以后。 中藥材市場收集的樣品中，收集日期為上半年的均為前一年所產(chǎn)，收集日期為下半年的均為當(dāng)年所產(chǎn)。 7 號(hào)樣品為研究者于2016 年上半年收集于樟樹某實(shí)驗(yàn)林場，為2016 年當(dāng)年所產(chǎn)。 所有樣品規(guī)格均為半球形，直徑為1～2 cm。 貯存條件為常溫（10 ～30 ℃），避光，密閉。 樣品由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容博士鑒定及與酸橙枳實(shí)對(duì)照藥材進(jìn)行薄層鑒別，所有樣品為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。 樣品保存于首都醫(yī)科大學(xué)中藥資源與鑒定實(shí)驗(yàn)室。

表1 酸橙枳實(shí)藥材信息表Tab 1 Information of immature fruit of citrus aurantium

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液：分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、新橙皮苷和川陳皮素對(duì)照品適量，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，質(zhì)量濃度分別為1.132、2.536、1.064、3.162 及1.066 g／L。 精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，置于25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.350 4 g／L 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。 精密稱取辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水定容至5 ml，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.246 mg／ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 供試品溶液：取枳實(shí)藥材粉末0.5 g（過65 目篩），精密稱定，置圓底燒瓶中，加水10 ml，100 ℃水浴提取1 h，過濾，將2 次濾液合并至蒸發(fā)皿中，濃縮至約10 ml，轉(zhuǎn)移至25 ml 容量瓶中，水定容至25 ml，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

（1）黃酮類化合物檢測(cè)色譜條件在參考文獻(xiàn)［8］的基礎(chǔ)上改進(jìn)如下。 WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；VanGuard 預(yù)柱；流動(dòng)相為水（A，含0.2%冰醋酸）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫條件為0～15 min，95%～80%A；15～25 min，80%～75%A；25～28 min，75%～60%A；28～35 min，60%～0%A）；檢測(cè)波長330 nm；柱溫30 ℃；流速0.3 ml／min；進(jìn)樣量1 μl，自動(dòng)進(jìn)樣。 （2）辛弗林檢測(cè)色譜條件如下。Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水（V∶V＝1 ∶1），水相中含磷酸二氫鉀0.06%、十二烷基磺酸鈉0.1%和冰醋酸0.1%；檢測(cè)波長275 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 ml／min；進(jìn)樣量10 μl，自動(dòng)進(jìn)樣。 酸橙枳實(shí)對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系及檢測(cè)限

將“2.1.1”項(xiàng)制得的樣品，分別稀釋至如下質(zhì)量濃度，依次自動(dòng)進(jìn)樣。 柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.507、1.014、1.521、2.028 及2.536 g／L。 新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為1.054、1.581、2.108、2.635 及3.162 g／L。 橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.116 8、0.175 2、0.233 6、0.292 0 及0.350 4 g／L。 蕓香柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.056 6、0.113 2、0.169 8、0.226 4 及0.283 0 g／L。 川陳皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.010 66、0.021 32、0.031 98、0.042 64 及0.053 30 g／L。 野漆樹苷對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.010 64、0.021 28、0.031 92、0.042 56 及0.053 20 g／L。 辛弗林對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.017 35、0.034 71、0.052 06、0.069 41、0.086 77及0.104 10 g／L。 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X（μg／ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算檢測(cè)限（S／N≥3）及定量限（S／N≥10），結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限和檢測(cè)限結(jié)果Tab 2 Standard curve and quantitation and detection limit results

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積以此計(jì)算RSD。 蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的RSD分別為0.71%、0.76%、1.11%、0.77%、0.91%、0.89%和0.46%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 和24 h 進(jìn)樣，以蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的色譜峰峰面積計(jì)算RSD，分別為1.44%、0.76%、4.37%、1.93%、0.72%、0.60%和2.38%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批枳實(shí)干燥粉末6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定枳實(shí)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林含量的RSD分別為1.59%、1.77%、2.34%、2.73%、1.76%、2.27%和1.38%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

分別稱取枳實(shí)干燥粉末5 份，每份約0.25 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液。 吸取已知含量（含生藥10 mg／ml）的5 份枳實(shí)水提供試液1 ml，分別精密加入等同于藥材樣品含量的7 種對(duì)照品，用甲醇定容至10 ml，混勻，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μl。 測(cè)定各成分的含量，計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n＝5）Tab 3 Recovery rates of spiked samples （n＝5）

2.8 樣品含量測(cè)定

取10 個(gè)不同批次的枳實(shí)藥材粉末（過65 目篩）約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)操作方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同貯存時(shí)間酸橙枳實(shí)藥材7 個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

表4 不同貯存時(shí)間酸橙枳實(shí)藥材7 個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

編號(hào) 蕓香柚皮苷 柚皮苷 野漆樹苷 橙皮苷 新橙皮苷 川陳皮素 辛弗林1 1.241 9±0.009 3 9.176 0±0.003 5 0.074 9±0.000 2 0.758 0±0.001 8 6.800 0±0.001 4 0.119 7±0.000 4 0.340 8±0.000 3 1.084 4±0.014 8 9.615 8±0.006 9 0.099 7±0.000 4 0.780 5±0.001 8 9.213 2±0.005 5 0.119 7±0.000 1 0.339 7±0.000 3 3 0.796 6±0.003 8 6.795 5±0.010 4 0.075 9±0.000 3 0.703 8±0.002 2 5.921 8±0.004 3 0.119 6±0.000 2 0.355 3±0.000 9 4 0.656 0±0.001 1 6.649 9±0.001 9 0.072 0±0.000 4 0.870 1±0.003 2 9.033 9±0.002 9 0.042 4±0.000 1 0.151 1±0.000 7 5 1.005 8±0.007 7 7.632 6±0.018 6 0.097 4±0.000 4 0.713 5±0.002 5 7.182 3±0.002 0 0.130 6±0.000 3 0.291 1±0.000 6 6 0.716 7±0.006 9 8.013 6±0.014 5 0.074 3±0.000 2 0.673 0±0.001 6 9.013 5±0.002 3 0.067 6±0.000 1 0.315 7±0.000 6 7 0.426 5±0.000 7 6.889 4±0.004 6 0.064 9±0.000 3 0.859 6±0.002 8 13.878 7±0.008 0 0.058 7±0.000 1 0.246 0±0.000 7 8 1.152 5±0.011 0 5.970 2±0.015 7 0.093 7±0.000 5 0.920 6±0.001 8 9.089 6±0.004 1 0.097 3±0.000 3 0.337 7±0.000 6 9 0.633 8±0.000 4 0.173 4±0.000 4 0.019 7±0.000 3 0.557 0±0.000 9 0.150 8±0.000 4 0.080 1±0.000 1 0.344 6±0.000 5 10 1.070 1±0.007 7 4.293 4±0.005 9 0.057 7±0.000 2 1.150 2±0.004 8 11.336 0±0.006 4 0.095 0±0.000 4 0.468 4±0.000 2 2

2.9 不同貯藏時(shí)間和藥效組分含量之間的關(guān)系

以貯藏時(shí)間為橫坐標(biāo)，藥效組分含量為縱坐標(biāo)做曲線圖，見圖2。 其中，貯存時(shí)間為6 年、4 年以及3 年對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)為2 號(hào)和3 號(hào)、5 號(hào)和6 號(hào)、7 號(hào)和8 號(hào)樣品中各成分含量的平均值。 比較不同貯藏時(shí)間的酸橙枳實(shí)中藥效組分蕓香柚皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素和辛弗林的含量隨貯存時(shí)間的變化趨勢(shì)。 枳實(shí)中辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素含量與貯存時(shí)間未呈現(xiàn)出遞減或遞增規(guī)律。 相同貯存時(shí)間的樣品中藥效組分的含量差異大于不同貯存時(shí)間的樣品，樣品的其他信息對(duì)于所測(cè)藥效組分的影響可能大于貯藏時(shí)間。 蕓香柚皮苷與橙皮苷含量波動(dòng)與貯存時(shí)間關(guān)系不大。 野漆樹苷與川陳皮素在枳實(shí)中含量較低，隨時(shí)間變化其含量變化幅度較小。 除了貯存時(shí)間為2 年的9 號(hào)樣品，其他樣品隨貯存時(shí)間延長柚皮苷含量有升高趨勢(shì)，新橙皮苷含量有降低趨勢(shì)。 辛弗林含量與貯存時(shí)間之間無明顯規(guī)律性。

圖2 酸橙枳實(shí)不同貯藏時(shí)間與其內(nèi)部各成分含量變化曲線圖Fig 2 Variation curve of different storage time and the contents of immature fruit of citrus aurantium

3 討論

3.1 關(guān)于研究樣品

樣品均為來源于酸橙的藥材枳實(shí)，規(guī)格均選擇了半球形，直徑為1～2 cm，排除了品種和規(guī)格的干擾，但未能完全排除產(chǎn)地、采收時(shí)間等其他因素的影響。 研究不同貯存時(shí)間對(duì)枳實(shí)質(zhì)量的影響，理想的樣品是同一批樣品在不同貯存年限時(shí)分別進(jìn)行藥效組分的含量測(cè)定，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。 本研究是選擇不同貯存時(shí)間的不同樣品進(jìn)行研究。 不同貯存時(shí)間的樣品為市場隨機(jī)抽取的樣品，但樣本量有限，未能做到同一貯存時(shí)間的多樣本重復(fù)研究。 針對(duì)研究中涉及的10 份樣品，在貯存7 年以內(nèi)的時(shí)限中，其辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素含量與貯存時(shí)間未呈現(xiàn)出遞減或遞增規(guī)律。

貯存時(shí)間為2 年的9 號(hào)樣品中，柚皮苷、新橙皮苷含量與貯存時(shí)間相鄰的1 年和3 年樣品相比分別相差近20 ～30 倍、60～70 倍。 推測(cè)與該樣品其他信息有關(guān)，與貯存時(shí)間無關(guān)。 故在做柚皮苷、新橙皮苷與貯藏時(shí)間相關(guān)趨勢(shì)分析時(shí)，剔除了該樣品。 但進(jìn)一步的藥效組分含量與貯藏時(shí)間的相關(guān)性分析還需更多的樣品研究支撐。

3.2 陳藥用藥及陳化時(shí)限的科學(xué)依據(jù)

陳藥的使用是中醫(yī)用藥的特色之一。 但對(duì)于陳藥用藥的科學(xué)依據(jù)，除陳皮外，其他陳藥陳用機(jī)制相關(guān)研究較為薄弱。 直接針對(duì)枳實(shí)陳用機(jī)制的研究報(bào)道不多。 根據(jù)目前對(duì)枳實(shí)化學(xué)成分的研究成果，結(jié)合陳皮陳用的機(jī)制研究結(jié)果［9-15］，推斷枳實(shí)陳用的機(jī)制可能是隨著貯存時(shí)間的延長其揮發(fā)油的含量降低，從而使其對(duì)胃腸道刺激的副作用降低。 在樣本量有限的前提下，本研究的數(shù)據(jù)依然提示，不同貯存時(shí)間的枳實(shí)樣品，其辛弗林和黃酮類藥效組分含量有所不同，有的波動(dòng)范圍較大。 其中，柚皮苷和新橙皮苷含量與貯存時(shí)間有一定關(guān)聯(lián)趨勢(shì)可循。 從前期眾多文獻(xiàn)報(bào)道中［16-20］可知，本研究中所用樣品測(cè)量出的藥效組分含量波動(dòng)并不大于文獻(xiàn)報(bào)道中產(chǎn)地、采收時(shí)間及品種等因素造成的含量波動(dòng)。 7 年內(nèi)不同貯存時(shí)間，酸橙枳實(shí)藥材質(zhì)量未見明顯差異，可作為枳實(shí)“陳久者良”的科學(xué)依據(jù)之一。 隨著枳實(shí)貯存時(shí)間的繼續(xù)延長，是否會(huì)對(duì)枳實(shí)的辛弗林和黃酮類藥效組分產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步追蹤，枳實(shí)的陳化時(shí)限還未能確定。 揮發(fā)油也是枳實(shí)的有效成分，并且揮發(fā)油含量與貯存時(shí)間的相關(guān)性較強(qiáng)。 枳實(shí)揮發(fā)油的含量與貯存時(shí)間的變化規(guī)律還需進(jìn)一步研究，同時(shí)輔以藥效組分與功效的量效關(guān)系研究，有望為枳實(shí)陳用及陳化時(shí)限提供更多的科學(xué)支撐。

3.3 辛弗林含量

影響枳實(shí)藥材生物堿含量的因素主要有品種、產(chǎn)地、規(guī)格、采收時(shí)間和貯存時(shí)間等［16-20］。 4 號(hào)、5 號(hào)和7 號(hào)樣品中辛弗林的含量未達(dá)到《中華人民共和國藥典》（2015 年版）要求的最低限度0.30%。 5 號(hào)和6 號(hào)樣品貯存時(shí)間均為7 年，產(chǎn)地均為江西，6號(hào)樣品辛弗林含量符合標(biāo)準(zhǔn)；7 號(hào)和8 號(hào)樣品貯存時(shí)間均為3年，8 號(hào)樣品辛弗林含量符合標(biāo)準(zhǔn)。 推測(cè)辛弗林含量未合格與其貯存時(shí)間、品種和規(guī)格關(guān)系不大，可能與樣品其他因素有關(guān)。

3.4 含量測(cè)定方法

本研究同時(shí)建立了UPLC 法測(cè)定枳實(shí)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷及川陳皮素6 種黃酮類成分的含量測(cè)定方法。 《中華人民共和國藥典》（2015 年版）枳實(shí)辛弗林含量測(cè)定方法中，對(duì)枳實(shí)樣品的處理步驟較復(fù)雜，本研究中簡化了樣品處理方法。 通過方法學(xué)考查，所建立的方法可行，可為定量評(píng)價(jià)枳實(shí)質(zhì)量提供參考。