阿帕替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖、凋亡及遷移的影響Δ

趙鵬飛，甄洪超，趙 磊，王 婧，曹邦偉1，#（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院放療科，北京 100050；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京 100050）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，最新統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2018 年度全球胃癌新發(fā)病例超過103 萬例，在所有惡性腫瘤中居第6位，其中新發(fā)死亡病例超過78 萬例，在所有惡性腫瘤中居第2位［1］。 我國最新數(shù)據(jù)評估結(jié)果顯示，2014 年胃癌新發(fā)病例在所有惡性腫瘤中居第2 位，死亡率居第3 位，僅次于肺癌和肝癌［2］。 胃癌治療手段包括手術(shù)、放療、化療和靶向治療［3］。 手術(shù)治療是早期胃癌首選治療方式，但由于早期癥狀不典型，絕大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已處于局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 此時(shí)，全身化療成為胃癌患者最主要的治療方式。 目前，鉑類藥物+氟尿嘧啶類藥物聯(lián)合應(yīng)用是晚期胃癌一線治療的首選方案，對于體力狀態(tài)評分較高者可考慮應(yīng)用鉑類藥物+氟尿嘧啶類藥物+蒽環(huán)類／紫杉類藥物的三聯(lián)用藥方案。 晚期胃癌患者單純化療預(yù)后極差，5 年生存率＜10%，中位總生存時(shí)間＜12 個(gè)月［4］。 近年來，以抗血管生成為靶點(diǎn)的藥物（如阿帕替尼）已成為晚期胃癌三線治療的重要手段之一，并取得了一定療效。本研究擬探討阿帕替尼聯(lián)合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）對于人胃癌細(xì)胞AGS 增殖、調(diào)亡及遷移的影響，以期在臨床上為體力狀態(tài)較好的胃癌患者應(yīng)用上述兩藥聯(lián)合治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN-45 及SGC-7901 由消化系統(tǒng)疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）購自美國ScienCell 公司，培養(yǎng)傳代于含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基，置于5% CO2的37°培養(yǎng)箱，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑：5-FU 注射液（0.25 g／10 ml，上海旭東海普公司），使用前以培養(yǎng)液稀釋為25、50 和100 μg／ml 的質(zhì)量濃度；阿帕替尼（0.425 g，江蘇恒瑞公司），用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，避光保存，使用前以培養(yǎng)液稀釋為15、30 和60 μg／ml 的質(zhì)量濃度；DMEM 培養(yǎng)基（美國康寧公司）；胎牛血清（BI 公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、Annexin V-FITC／PI 細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基生物公司）；MTS試劑（美國Promega 公司）；抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）抗體（美國Abcam公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體、羊抗兔二抗（美國SAB 公司）；蛋白酶抑制劑（美國AMRESCO 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京CWBIO 公司）；RIPA 裂解液（北京普利萊基因公司）。

1.2 MTS 法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞AGS 接種于96 孔板，每孔細(xì)胞懸液+培養(yǎng)基100 μl（1×104個(gè)細(xì)胞／孔），24 h 待細(xì)胞完全貼壁后，空白對照組添加同樣體積DMSO（藥物溶劑），換液后繼續(xù)加用DMEM 完全培養(yǎng)基；5-FU 單藥組分別以25、50 和100 μg／ml 質(zhì)量濃度的5-FU 干預(yù)；阿帕替尼單藥組分別以15、30 和60 μg／ml 質(zhì)量濃度的阿帕替尼干預(yù)；每組3 個(gè)負(fù)孔。 培養(yǎng)24 或48 h 后，每孔加入MTS 試劑20 μl，置于5% CO2的37°培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測490 nm 的光密度（optical density，OD）。 各組結(jié)果兩兩對比，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。 5-FU選取100 μg／ml、阿帕替尼選取30 μg／ml 作為2 藥聯(lián)合應(yīng)用的濃度。 由公式計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝（對照組OD 490 nm-實(shí)驗(yàn)組OD 490 nm）／對照組OD 490 nm×100%。

1.3 Annexin V-FITC／PI 雙染法流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞AGS 接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 貼壁后，空白對照組處理方法同MTS 法；實(shí)驗(yàn)組分別加入5-FU 100 μg／ml、阿帕替尼30 μg／ml 及5-FU 100μg／ml+阿帕替尼30 μg／ml 聯(lián) 合。 培 養(yǎng)24 h 后， 將 懸 浮 細(xì) 胞 離 心（2 000 轉(zhuǎn)／min，離心5 min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，用冰PBS 洗滌2 次離心后（2 000 轉(zhuǎn)／min，離心5 min）收集細(xì)胞；加入500 μl 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μl 的Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μl 的碘化丙啶（PI），混勻；室溫（15～25 ℃）下避光，反應(yīng)5～15 min；在30 min 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 劃痕試驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力

取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞AGS 接種于6 孔板中，孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，過夜鋪滿后以不含血清的不完全培養(yǎng)基處理12 h，后用無菌槍頭比著直尺，在板底垂直向畫十字，用PBS 清洗2 次去除劃下的細(xì)胞，細(xì)胞的藥物處理同“1.3”項(xiàng)下方法，以無血清培養(yǎng)基稀釋藥物。 置于5% CO2的37°培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于0 和24 h 顯微鏡下取樣，拍照，記錄細(xì)胞遷移情況。 細(xì)胞遷移速率＝（0 h 邊緣距離-24 h 后邊緣距離）／24 h。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 Western Blot 法檢測蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的AGS 及HUVEC 接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長24 h 后，用RIPA 裂解液+PMSF+PhosSTOP 磷酸酶抑制劑提取總蛋白，進(jìn)行BCA 蛋白定量。 經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜、BSA 封閉、一抗4°孵育過夜、TBST 清洗、二抗孵育、TBST 洗膜和PhototopeTM-HRP 化學(xué)發(fā)光試劑封閉后，在暗室壓片后以自動(dòng)X-光膠片機(jī)曝光，觀察記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

不同組間差異通過方差分析方法進(jìn)行檢查，采用SPSS 17.0 及GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌細(xì)胞AGS 系中VEGFR2 蛋白表達(dá)情況

Western Blot 法檢測結(jié)果顯示，GADPH 作為內(nèi)參，陽性對照HUVEC 細(xì)胞內(nèi)可見VEGFR2 蛋白表達(dá)，人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中可見VEGFR2 蛋白表達(dá)，而人胃癌細(xì)胞系MKN-45 及SGC-7901 并無VEGFR2 蛋白表達(dá)；后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取表達(dá)VEGFR2 的人胃癌細(xì)胞AGS 進(jìn)行，見圖1。

圖1 Western Blot 法檢測HUVEC、AGS、MKN-45 和SGC-7901 中VEGFR2 的表達(dá)Fig 1 Expression of VEGFR2 in HUVEC， AGS， MKN-45 and SGC-7901 detected by Western Blot

2.2 MTS 法測定5-FU、阿帕替尼和聯(lián)合用藥對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖的影響

人胃癌細(xì)胞AGS 經(jīng)不同濃度5-FU 及阿帕替尼處理24 及48 h 后，25、50 和100 μg／ml 的5-FU 單藥以及15、30 和60 μg／ml的阿帕替尼單藥均可抑制人胃癌細(xì)胞AGS 增殖，并具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性，見圖2（A、B）。 5-FU 質(zhì)量濃度為100 μg／ml時(shí)對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖的抑制程度，與空白對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；阿帕替尼質(zhì)量濃度為30 μg／ml 時(shí)對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖的抑制程度，與空白對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；阿帕替尼30 μg／ml 與5-FU 100 μg／ml 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)，與各單藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)果提示，5-FU與阿帕替尼聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)對人胃癌細(xì)胞AGS 生長的抑制作用，且具有協(xié)同效應(yīng)，圖2（A、B）。 光學(xué)顯微鏡觀察對照組、阿帕替尼30 μg／ml、5-FU 100 μg／ml 以及阿帕替尼30 μg／ml 與5-FU 100 μg／ml 聯(lián)合處理24、48 h 后細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示，空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，結(jié)構(gòu)緊湊，形態(tài)正常；阿帕替尼單藥組、5-FU 單藥組細(xì)胞生長稀疏，部分細(xì)胞死亡，48 h后上述2 組細(xì)胞生長嚴(yán)重稀疏，大部分細(xì)胞死亡，以5-FU 組更甚；阿帕替尼與5-FU 聯(lián)合組細(xì)胞狀態(tài)差，生長更稀疏，死亡細(xì)胞明顯增多，形態(tài)變圓或各異，圖2（C、D）。

圖2 MTS 法測定四組人胃癌細(xì)胞AGS 的增殖情況Fig 2 Proliferation of AGS cells of the four groups detected by MTS

2.3 Annexin V-FITC／PI 流式雙染法檢測人胃癌細(xì)胞AGS的凋亡

Annexin V-FITC／PI 流式雙染法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，阿帕替尼30 μg／ml 單藥組、5-FU 100 μg／ml 單藥組處理人胃癌細(xì)胞AGS 24 h 后，人胃癌細(xì)胞AGS 總凋亡比例升高（14.1% vs.17.5%；14.1% vs.24.5%）［見圖3（A、B）］，以晚期凋亡（Q2）細(xì)胞為主（5.9% vs.11.7%；5.9% vs.16.9%）［見圖3（C）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；阿帕替尼與5-FU 聯(lián)合組人胃癌細(xì)胞AGS 總凋亡比例（45.8%）較單藥組明顯升高，仍以晚期凋亡細(xì)胞為主（37.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖3。

2.4 劃痕試驗(yàn)測定四組人胃癌細(xì)胞AGS 遷移能力的變化

與對照組比較，作用24 h 后阿帕替尼30 μg／ml 單藥組、5-FU 100 μg／ml 單藥組人胃癌細(xì)胞AGS 的劃痕愈合速度減慢，空白對照組為0.211 0 mm／h，5-FU 單藥組為0.173 0 mm／h，阿帕替尼單藥組為0.096 0 mm／h，見圖4（A）；阿帕替尼30 μg／ml與5-FU 100 μg／ml 聯(lián)合組人胃癌細(xì)胞AGS 的劃痕愈合速度進(jìn)一步減慢，為0.020 7 mm／h；結(jié)果提示，與空白對照和阿帕替尼、5-FU 單藥相比，5-FU 聯(lián)合阿帕替尼對人胃癌細(xì)胞AGS 的遷移有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖4（B）。

3 討論

腫瘤血管生成與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5-7］。 其中，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）及VEGFR2 與腫瘤血管新生最相關(guān)，后者約在36%～40%的胃癌組織中過表達(dá)［8］。 血管內(nèi)皮生長因子受體1 或VEGFR2 起初被認(rèn)為僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，隨后越來越多的研究結(jié)果證實(shí)，VEGFR2 不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞也有表達(dá)［9］。 Zhang等［10］研究結(jié)果顯示，包括AGS 在內(nèi)的多種人胃癌細(xì)胞系中可均見VEGFR2／KDR 基因擴(kuò)增；胃癌組織免疫組化結(jié)果提示，除血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)KDR 外，約70%的胃癌組織標(biāo)本均可見KDR 表達(dá)陽性，且KDR 受體是有功能的。 本研究中，Western Blot 檢測結(jié)果顯示，以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞為陽性對照，人胃癌細(xì)胞AGS 可見VEGFR2 表達(dá)，而MKN-45 及SGC7901 未見VEGFR2 表達(dá)。

圖3 Annexin V-FITC／PI 流式雙染法檢測四組人胃癌細(xì)胞AGS 的凋亡情況Fig 3 AGS cell apoptosis in the four groups detected by Annexin V-FITC／PI staining flow cytometry

在胃癌抗血管生成治療中，靶向VEGF 單克隆抗體貝伐單抗聯(lián)合化療與單純化療相比并無生存獲益［11］。 Ⅲ期RAINBOW 試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，晚期胃癌患者一線鉑類藥物+氟尿嘧啶類藥物治療失敗后，二線應(yīng)用抗VEGFR2 單克隆抗體雷莫盧單抗+紫杉醇可延長總生存期（overall survival，OS）2.2 個(gè)月［12］。 目前，雷莫盧單抗被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于一線鉑類藥物+氟尿嘧啶類藥物化療失敗后的晚期胃癌或胃食管結(jié)合部腫瘤患者的二線治療。 多種化療藥（包括5-FU）用于胃癌標(biāo)準(zhǔn)一線或二線治療，但化療效果并不樂觀，且二線治療失敗后缺乏標(biāo)準(zhǔn)治療方案，而相當(dāng)一部分患者二線治療失敗后體力狀況尚良好，能耐受進(jìn)一步治療，仍需安全且有效的治療手段延長患者的生存時(shí)間。 Li 等［13］的研究結(jié)果顯示，與安慰劑相比，靶向VEGFR2 的小分子酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼作為三線治療策略可以延長晚期胃癌患者無進(jìn)展生存時(shí)間（progression-free survival，PFS）及OS，差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但PFS 僅延長25 d，OS 僅延長55 d。 5-FU 是胃癌經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物之一，為嘧啶類抗代謝藥，主要通過阻止脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA 的合成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。 目前，臨床中已有關(guān)于阿帕替尼聯(lián)合化療藥如替吉奧、多西他賽作為一線或二線方案治療晚期胃癌的嘗試［14-15］。 為探究阿帕替尼聯(lián)合化療藥用于二線治療失敗后體力狀況尚可的患者能否同雷莫盧單抗聯(lián)合化療藥一樣進(jìn)一步改善晚期胃癌患者的生存結(jié)局，本研究進(jìn)行了阿帕替尼聯(lián)合5-FU 對人胃癌細(xì)胞AGS 增殖、凋亡及遷移影響的體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步為阿帕替尼聯(lián)合化療藥的應(yīng)用臨床提供理論基礎(chǔ)。

圖4 劃痕試驗(yàn)測定四組人胃癌細(xì)胞AGS 遷移能力變化情況Fig 4 Changes of AGS cells migration in the four groups detected by scratch test

本研究結(jié)果顯示，與不同濃度的阿帕替尼單藥、5-FU 單藥相比，阿帕替尼30 μg／ml 與5-FU 100μg／ml 聯(lián)合作用24 或48 h 后，可顯著抑制人胃癌細(xì)胞AGS 增殖。 凋亡受阻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，許多化療藥、活性成分和靶向藥物均能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤生長［16］。 本實(shí)驗(yàn)中，Annexin V-FITC／PI 雙染結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼30 μg／ml 與5-FU 100 μg／ml聯(lián)合用藥組人胃癌細(xì)胞AGS 的凋亡率較對照組明顯升高，以晚期調(diào)亡細(xì)胞為主，且聯(lián)合用藥組人胃癌細(xì)胞AGS 的遷移能力明顯降低。 梁樹等［17］在研究阿帕替尼對白血病HL-60 細(xì)胞株抑制增殖作用及機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼可通過下調(diào)P-Erk1／2 及P-Akt 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。 Liu 等［18］的研究結(jié)果顯示，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)阿帕替尼可通過VEGFR2／STAT3／BCL-2 信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞調(diào)亡和自噬。 Huang 等［19］的研究結(jié)果顯示，阿帕替尼可通過阻斷VEGFR2／RAF／MEK／ERK 和PI3K／AKT 通路，影響由VEGF 介導(dǎo)的膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。 本研究初步報(bào)道了阿帕替尼聯(lián)合5-FU 對人胃癌細(xì)胞AGS 生物學(xué)表型的影響，但不足的是，本研究僅從單一細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且尚未對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。 后續(xù)將對相關(guān)結(jié)果在其他細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證，并重點(diǎn)分析阿帕替尼聯(lián)合5-FU 對細(xì)胞增殖、調(diào)亡及遷移影響的分子機(jī)制。

綜上所述，在體外實(shí)驗(yàn)中，阿帕替尼聯(lián)合5-FU 可顯著抑制人胃癌細(xì)胞AGS 增殖、遷移，并可誘導(dǎo)其調(diào)亡。 本研究可為臨床上二線治療后疾病進(jìn)展但體力狀態(tài)評分尚好的晚期胃癌患者聯(lián)合應(yīng)用阿帕替尼與5-FU 提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。