大氣CO2濃度升高對鰻草植株生長的影響?

張 玉， 許軍閣， 劉雨昕， 周玥瑤， 劉 欣， 賀 星， 張沛東

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003)

工業(yè)革命以來，隨著全球經(jīng)濟的飛速發(fā)展，化石燃料的大量使用、森林的大肆砍伐以及土地的不合理開發(fā)利用等人類活動導致CO2大量排放，到2013年大氣CO2濃度已由工業(yè)革命前的180×10-6～280×10-6上升到近400×10-6，并以每年約0.5%的速率繼續(xù)增加，據(jù)估計到21世紀末，大氣CO2濃度將達到700×10-6～800×10-6[1-3]。大氣CO2濃度的大幅升高，導致全球性的溫室效應，引發(fā)了全球變暖、干旱頻發(fā)、海平面升高等一系列環(huán)境變化。同時，人類排放的約1/3的CO2被海洋吸收使得全球海洋出現(xiàn)了嚴重酸化。相對于工業(yè)革命前，2007年海水pH已下降0.1個pH單位，預計到21世紀末海水pH還會下降0.3～0.4個單位，到2300年將降低0.7～0.8個單位[4-8]。海洋酸化及伴隨的海水碳酸鹽化學體系的變化對海洋生物產(chǎn)生深遠的影響，特別是對海洋鈣化生物造成嚴重損害，如貝類和棘皮動物在鈣化早期對海洋酸化尤其敏感，其幼體存活率受到海洋酸化的嚴重制約[9-10]。此外，海洋酸化可以促進固氮和脫氮過程同時削弱硝化作用，改變?nèi)苎鯘舛确植己徒饘俚纳锟衫眯裕瑥亩鴮Ｑ笊锂a(chǎn)生間接影響[6]。

鰻草(ZosteramarinaL.)是北半球溫帶海域海草的優(yōu)勢種，屬鰻草科(Zostreraceae)鰻草屬(Zostera)，通常在沿海潮間帶和潮下帶較淺的水域形成繁茂群落，從而為魚類和貝類等海洋動物提供多樣的餌料場、棲息場和育幼場，具有極高的生態(tài)服務價值[28-29]。為探明大氣CO2濃度增加對鰻草植株存活和生長的影響及其生理適應過程，實驗室條件下模擬大氣CO2濃度的升高幅度和升高過程，監(jiān)測植株的存活、生長狀況以及氣道面積，測定植株葉片的光合色素含量、過氧化物酶(POD)活性、可溶性糖含量，明確鰻草植株應對大氣CO2濃度升高的響應過程。研究結(jié)果不僅可以進一步查明全球氣候變化對海洋生物的影響，還可為豐富鰻草生理生態(tài)學理論提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2017年4月在中國海洋大學增殖生態(tài)學實驗室進行。實驗用鰻草植株采自山東省青島市匯泉灣鰻草草床。采集時，用手從鰻草植株底部連根挖取，確保植株完整。植株經(jīng)海水充分浸洗，去除雜質(zhì)、貝類及葉片附生生物，放入盛有海水的泡沫箱運回實驗室，置于室外大型水槽暫養(yǎng)7 d。

1.2 CO2濃度控制與實驗系統(tǒng)

實驗用培養(yǎng)箱為55 cm×40 cm×50 cm的玻璃水槽。實驗時，水槽上表面用耐高溫透光塑料膜密封，其中對照組(CO2濃度380×10-6)水槽上表面不密封；水槽1個側(cè)面距離上表面10 cm開有一個直徑為1.7 cm的圓孔，并用玻璃膠固定一根長10 cm的玻璃管于開孔處，玻璃管內(nèi)側(cè)與水槽氣體相聯(lián)通外側(cè)連接橡膠管，供CO2氣體通入。橡膠管連接多頭可控氣體閥、微調(diào)閥和計泡器，最后接入CO2氣瓶。

實驗時，氣體的少量泄漏及植物光合作用等，會造成實驗組培養(yǎng)箱CO2濃度下降。為確保各實驗組的CO2濃度變化幅度不超過設置值的5%，實驗過程中使用CO2濃度檢測儀(衡欣，VZ7788BZ)對各實驗組CO2濃度進行實時監(jiān)測，并通過調(diào)節(jié)可控氣體閥、微調(diào)閥和計泡器實現(xiàn)對CO2濃度的有效控制。具體調(diào)節(jié)過程如下：逐個調(diào)節(jié)接入培養(yǎng)箱的可控氣體閥和微調(diào)閥，觀察計泡器中每兩個氣泡出現(xiàn)的時間間隔以及培養(yǎng)箱中CO2濃度，使單位時間內(nèi)培養(yǎng)箱的進氣量保持恒定，CO2得到及時補充，以維持恒定的CO2濃度。由于一天中不同時間段植物的光合速率和呼吸速率不同，導致CO2濃度在不同時間段呈現(xiàn)不同程度下降。因此于實驗期間的每天07:00、12:00、17:00和22:00采用上述調(diào)節(jié)方法，分別對各實驗組的CO2補充量進行調(diào)整。

1.3 實驗設計與過程

實驗設置4個CO2濃度，分別為380×10-6(對照組，當前大氣CO2濃度)、750×10-6(對應21世紀末大氣CO2濃度)、1 900×10-6(對應23世紀末大氣CO2濃度)以及變化組(實驗期間，按照約50×10-6/d的速率逐步由380×10-6升高至1 900×10-6)。通過前期預實驗，得出不同濃度實驗組鰻草晝夜消耗CO2的速率以及微調(diào)閥控制的補氣速率，以計泡器為輔，每日調(diào)節(jié)微調(diào)閥使各組補充CO2的速率等于CO2的消耗速率。

每個實驗組設置8個重復，每個重復使用6株植株，每4個重復放置于1個玻璃水槽，全部實驗共種植192株植株，使用8個玻璃水槽。實驗時，選取長勢良好的植株進行實驗。為標準化實驗，選取具有相似形態(tài)學特征的植株進行實驗，即株高12～18 cm、葉片3～4片、根狀莖4 cm，并對其進行標記。標記時，在各植株維管束頂端即分生組織上方1 cm處用細針扎孔。

實驗于室外進行30 d。實驗期間，光照強度、水溫、光照周期均與自然變化相同，海水為自然海水，玻璃水槽底部鋪設砂泥混合底質(zhì)，厚度5 cm，每5 d換水一次。

1.4 樣品采集與測定

實驗期間，每天測定各實驗組的CO2濃度(CO2濃度檢測儀；衡欣VZ7788BZ)，使用 CO2SYS 軟件計算二氧化碳分壓(pCO2)；利用YSI 6600多參數(shù)水質(zhì)儀(美國YSI公司)測定水體的水溫、鹽度和pH，利用AS-ALK2總堿度分析儀(美國APOLLO公司)測定實驗海水總堿度(TA)。

實驗結(jié)束后，觀察并記錄鰻草植株的存活情況，計算各實驗組的存活率。每實驗組隨機選取10株植株進行葉片光合色素含量測定，另隨機選取5株植株進行酶活力和可溶性糖含量測定，隨機選取5株進行氣道面積的測定，余下植株進行生長指標測定。

1.4.1 植株生長指標 鰻草植株清水洗凈后，用吸水紙拭去水分，保證根、莖、葉完整，然后根據(jù)針孔標記的情況測量植株新生組織的葉長、葉寬、莖節(jié)長、莖節(jié)直徑。根據(jù)葉長和葉寬計算單株葉片面積，即實驗期間單株全部新生葉片的葉長與葉寬乘積之和(cm2·shoot-1)；根據(jù)單株新生葉片總長計算葉片延伸率，即單株新葉總長除以實驗天數(shù)(cm·shoot-1·d-1)；根據(jù)新生莖節(jié)總長計算莖節(jié)延伸率，即單株新生莖長除以實驗天數(shù)(mm·shoot-1·d-1)。植株生產(chǎn)力測定時，根據(jù)標記結(jié)果，分別將植株地上組織的新生葉片和地下組織的新生莖節(jié)用剪刀剪下，去離子水清洗后置于60 ℃烘箱中烘干48 h至恒重，測量各組織干重，計算公式參照文獻[30-31]。

1.4.2 葉片光合色素含量 鰻草植株葉片光合色素含量的測定采用二甲基甲酰胺法，即取每株植株第二片新鮮葉片2 cm2，置于10 mL離心管中，加入5 mL二甲基甲酰胺(DMFO)，避光保存3 d，然后用分光光度計進行測定。以DMFO為空白，分別于665、652、649和470 nm測定吸光度值(OD)，計算公式為：

葉綠素a含量=(13.95D665-6.88D649)V/S；

葉綠素總含量=(1 000/34.5×D652)V/S；

類胡蘿卜素含量=(4.08D470-11.56D649+3.29D665)V/S。

式中：D為吸光度值(mg·mL-1)；V為提取液體積(mL)；S為葉片鮮重面積(cm2)，各色素含量單位為mg·cm-2。

1.4.3 葉片POD活力和可溶性糖含量 實驗結(jié)束后，將植株葉片用海水清洗干凈，干紗布拭去多余水分，迅速于-80 ℃保存。過氧化物酶(POD, U·mg-1)活力的測定采用比色法，使用南京建成生物工程研究所POD測試盒(A084-3)進行?？扇苄蕴呛?%)的測定使用蒽酮法，即將植株取出清洗干凈后，將其放入烘箱中烘干至恒重，磨碎稱取10 mg，加入8 mL乙醇提取100 min，3 500 r·min-1離心5 min，取提取液1 mL，加入5 mL蒽酮試劑，搖勻，沸水浴中顯色10 min，取出冷卻，在波長625 nm處比色測定吸光值。計算公式如下：

Y=C×V/(M×106)×100%。

式中：Y為樣品中可溶性糖含量(%)；C為提取液的葡萄糖含量(μg/mL)；V為樣品稀釋后的體積(mL);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.4.4 葉片及莖節(jié)橫切面氣道面積 將待測的鰻草植株清洗干凈后放入盛有海水的培養(yǎng)皿中，每個待測植株取第二片新鮮葉片及第二個新生莖節(jié)進行切片，切片厚度為1 mm左右，然后在變焦體視顯微鏡(Nikon，SMZ1000)下進行觀察并拍照，然后使用Image Pro軟件對所拍攝的照片進行氣道面積的計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

各實驗組數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，首先進行單因素方差分析(ANOVA)，差異顯著時使用Tukey多重比較分析組間差異。數(shù)據(jù)分析使用SPSS20.0進行，以P<0.05作為差異顯著水平，以P<0.01作為差異極顯著水平。分析結(jié)果使用Origin Pro 2015軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境因子

實驗期間，各實驗組環(huán)境因子的變化如表1所示。水溫和鹽度保持穩(wěn)定，平均值分別為17.9 ℃和32。海水pH隨CO2濃度的增加逐漸下降，而pCO2則逐步升高(P<0.05)?？倝A度(TA)的變化不明顯(P>0.05)。

表1 實驗期間各實驗組環(huán)境因子的變化(平均值±標準差)

2.2 成活率

實驗期間，除750×10-6濃度組有1株植株死亡外，其余3個濃度組的鰻草植株均生長良好，未出現(xiàn)死亡情況。

2.3 生長指標

植株葉片延伸率的變化如圖1(a)所示。隨CO2氣體濃度增加，葉片延伸率呈逐漸上升趨勢，在1 900×10-6時達到最大值，顯著高于對照組(P<0.05)，是對照組的1.41倍，其它各實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。各實驗組的單株葉面積和莖節(jié)延伸率均無明顯變化，平均值分別為19.2～25.3 cm2·shoot-1和1.03～1.11 mm·shoot-1·d-1(見圖1(b)～(c))。各實驗組植株莖節(jié)直徑的變化與葉片延伸率一致，隨CO2氣體濃度增加，莖節(jié)直徑呈逐漸上升趨勢，在1 900×10-6時達到最大值(3.0 mm)，顯著高于對照組(P<0.05)(見圖1(d))。

(數(shù)據(jù)為平均值±標準差，誤差線上的不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)；F表示CO2氣體濃度變化實驗組，即CO2氣體濃度隨實驗時間變化逐步由380×10-6升高至1 900×10-6。下同。Data are means ±S.D. of means. Different letters above error bars indicate significant differences among the treatments (P< 0.05). F represents the fluctuating group of which the CO2concentration changes over time from 380×10-6to 1 900×10-6. The same below.)

圖1 不同CO2濃度鰻草植株葉片延伸率(a)、單株葉面積(b)、莖節(jié)延伸率(c)、莖節(jié)直徑(d)的變化

Fig.1 Changes in (a) leaf elongation rate, (b) leaf area per shoot, (c) internode elongation rate and
(d) internode diameter ofZ.marinaplants under different CO2concentrations

鰻草植株生產(chǎn)力的變化如表2所示。單因素方差分析顯示，各實驗組之間地上生產(chǎn)力、地下生產(chǎn)力及總生產(chǎn)力均無顯著差異(P>0.05)，其平均值分別為3.6，2.3和5.4 mg DW·shoot-1·d-1。

表2 不同CO2濃度鰻草植株生產(chǎn)力的變化(平均值±標準差)

2.4 光合色素含量

鰻草葉片光合色素含量的變化如表3所示。結(jié)果顯示，不同CO2濃度對植株葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均無明顯影響(P>0.05)。但不同CO2濃度對植株葉片的葉綠素a含量與葉綠素b含量之比具有顯著影響，其比值隨CO2濃度升高而逐漸增大，并于1 900×10-6時達到最大值，顯著高于380×10-6和750×10-6實驗組(P<0.05)(見圖2)。

表3 不同CO2濃度鰻草植株光合色素含量的變化(平均值±標準差)

圖2 不同CO2濃度鰻草植株葉綠素a含量與葉綠素b含量之比的變化

2.5 POD活力和可溶性糖含量

鰻草植株P(guān)OD活力的變化如圖3所示。隨CO2氣體濃度增加，植株P(guān)OD活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并于750×10-6時達到最大值(25.9 U/mL)，顯著高于對照組和濃度變化實驗組(P<0.05)，分別是這兩個實驗組的2.4和2.2倍。鰻草植株可溶性糖含量的變化如圖4所示。隨CO2氣體濃度增加，植株可溶性糖含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，并于1 900×10-6時達到最大值(35.3%)，顯著高于對照組和濃度變化實驗組(P<0.05)，是這兩個實驗組的1.6倍。

圖3 不同CO2濃度鰻草植株過氧化物酶活力的變化

圖4 不同CO2濃度鰻草植株可溶性糖含量的變化

2.6 橫切面氣道面積

鰻草植株葉片和莖節(jié)的結(jié)構(gòu)盡管相對簡單，但是氣道非常發(fā)達，從而能夠更好地適應沉水生活(見圖5)。隨著CO2氣體濃度增加，植株莖節(jié)橫切面氣道面積呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，于1 900×10-6時達到最大值(0.54 mm2)，顯著高于對照組和濃度變化實驗組(P<0.05)，分別是這兩個實驗組的1.7和1.5倍(見圖6(a))。隨CO2氣體濃度增加，植株葉片橫切面氣道面積也呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，于1 900×10-6時達到最大值(0.53 mm2)，顯著高于對照組(P<0.05)，是對照組的2.1倍(見圖6(b))。

(1 薄壁組織；2 葉脈；3 中央維管束；4 氣道。1 Parenchyma；2 Leaf vein；3 Central vascular bundle；4 Airway.)

圖5 鰻草葉片橫切面(左)和莖節(jié)橫切面(右)示意圖

Fig.5 The pictures of leaf transverse airway (left) and internode transverse airway (right) ofZ.marinaplants

圖6 不同CO2濃度鰻草植株莖節(jié)橫切面氣道面積(a)和葉片橫切面氣道面積(b)的變化

3 討論

3.1 大氣CO2濃度升高對植物存活和生長的影響

3.2 海草對大氣CO2濃度升高的生理響應

本研究結(jié)果顯示，隨大氣CO2濃度升高，鰻草植株的葉綠素a/b、可溶性糖含量和氣道面積等指標均呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，并在1 900×10-6時達到最大值。葉綠素a是海草植株的主要光合色素，其隨大氣CO2濃度的升高而增加，表明大氣CO2濃度的升高對鰻草植株葉片的光合能力具有明顯的促進作用[32]?？扇苄蕴亲鳛楹粑孜餅橹参锏纳L發(fā)育提供能量，從而有效促進植株莖蔓伸長和葉片生長[33-34]。植物可借助通氣組織為葉片和根系提供呼吸代謝所需的O2，且O2的釋放量與通氣組織的發(fā)達程度呈正相關(guān)關(guān)系，因此氣道截面積的增加有利于植株氣體交換能力的提升，進而提高光合效率[35-37]。此外，通氣組織還是CO2的儲存庫，植株夜間吸收的CO2除部分同化為羧酸供白天光合作用時使用外，其余則儲存于通氣組織中備用[36]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高，鰻草植株的POD活性隨之升高，其中750×10-6濃度組和1 900×10-6濃度組鰻草植株的POD活性顯著高于對照組和濃度變化組。這可能是因為CO2濃度升高后，消除了植株光合作用的碳限制，光合固碳量增加，從而導致活性氧產(chǎn)量增加，這時作為抗氧化防御系統(tǒng)的主要成分POD酶的含量相應增加，清除體內(nèi)多余的活性氧，以減少對植株的傷害[38-40]。

4 結(jié)語

本研究發(fā)現(xiàn)，大氣CO2濃度升高對鰻草的存活無明顯影響，但對其葉片生長具有顯著的促進作用。當大氣CO2濃度升高至1 900×10-6時，鰻草的葉片延伸率達到最大值，促生作用最明顯。本研究明確了大氣CO2濃度升高對鰻草存活和生長的影響，初步查明了鰻草植株應對大氣CO2濃度升高的生理響應過程，為了解海草床生態(tài)系統(tǒng)的自我維持能力及其科學保護提供了理論依據(jù)和科學基礎(chǔ)。然而，大氣CO2濃度升高還伴隨著溫室效應引起的全球氣溫升高以及海水pCO2升高引起的海洋酸化，因此在大氣CO2濃度升高引起的綜合效應下，天然海草床生態(tài)系統(tǒng)的響應過程仍需進一步研究。