救必應(yīng)化學(xué)成分的分離與鑒定

陳曼鈿，柳新然，張 琳，李 玲，李百檸，陳麗亞，陳 苗，陳 剛，李 寧

（沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

救必應(yīng)（Ilex rotundaThunb.）又稱山冬青、熊膽木、白木香等，為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬植物鐵冬青的干燥樹皮或根皮。廣泛分布于東亞地區(qū)（中國、日本、韓國及越南等）[1]，在我國主要分布于安徽、江蘇、福建、廣東、廣西、云南、臺灣等地[2]，為華南地區(qū)常用中草藥。救必應(yīng)味苦，性寒，歸肺、肝、大腸經(jīng)，有瀉火解毒、清熱利濕、行氣止痛、涼血止血等功效，民間主要用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、暑濕泄瀉、急性胃腸炎，風(fēng)濕痹痛等；外用治跌打損傷、燒燙傷、癰癤瘡瘍、外傷出血等[3]。因其治療跌打損傷、燒燙傷的效果顯著，故美其名為救必應(yīng)[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，救必應(yīng)具有抗心律失常、降低冠脈流量、提高耐缺氧能力、降壓、止血、抗炎、抑菌及抗腫瘤等藥理作用。臨床上救必應(yīng)常應(yīng)用于治療胃腸道消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病、以及多種感染性疾病[5]。本實驗對救必應(yīng)95 %乙醇提取物的乙酸乙酯層的化學(xué)成分進(jìn)行分離與純化，并根據(jù)理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。共分離得到6個化合物，分別鑒定為3, 4-dihydroxy-acetophenone（1）、threo-8S-7-methoxysyringylglycerol（2）、2, 3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)-1-propanone（3）、caffeic acid (1-hydroxyl-4-O-β-D-glucopyranosylprenyl)-ester（4）、長梗冬青苷（pedunculoside，5）、rotungenoside（6）、救必應(yīng)酸（rotundic acid，7）、rotungenic acid（8），其中化合物1～4為首次從冬青屬植物分得。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker-ARX-400型，Bruker-AV-600型核磁共振波譜儀（TMS內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker）；microTOFQ Bruker質(zhì)譜儀（瑞士Bruker）；Shimadzu LC-6AD 高效液相色譜儀（SPD-20A UV-VIS型紫外檢測器，RID-10A型示差檢測器，日本Shimadzu公司）。分析型色譜柱：Unitary C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；YMC C18（10 mm×250 mm，5 μm）半制備型色譜柱；YMC C18（20 mm×250 mm，5 μm）制備型色譜柱； 341MC型旋光儀（Perkin-Elmer）；JASCO pu-2080高效液相儀（日本Jasco公司）；柱色譜硅膠（200～300目），薄層色譜硅膠GF（10～40 μm，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB）；ODS（50 μm，日本YMC公司）。

1.2 試藥

救必應(yīng)飲片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)提供，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)潘英妮副教授鑒定為救必應(yīng) （Ilex rotunda Thunb.）的干燥樹皮。石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇，均為分析純（山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）；甲醇（色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）；乙腈（色譜純，Sigma）；甲酸（色譜純，沈陽試劑一廠）。

2 提取與分離

救必應(yīng)乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠吸附柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫。同時用制備薄層色譜、ODS柱色譜、重結(jié)晶及制備型高效液相色譜（HPLC）等方法進(jìn)行分離純化，得到化合物1（42.7 mg），2（2.8 mg），3（6.0 mg），4（15.2 mg），5（61.6 g），6（50.0 mg），7（7.0 g），8（7.0 mg）。并通過理化性質(zhì)和波譜學(xué)特征確定其結(jié)構(gòu)。化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）給出3個芳香質(zhì)子信號δ 7.41（2H，m，H-2，6），6.82（1H，d，J=8.0 Hz，H-5）和一個甲基信號δ 2.48（3H，s，8-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）給出了1個羰基碳信號δ 199.8（C=O），6個芳香碳信號δ 130.8（C-1），116.2（C-2），146.5（C-3），152.4（C-4），115.9（C-5），123.6（C-6），和1個甲基信號26.3（C-8）。將以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]比較，鑒定化合物1為3, 4-二羥基苯乙酮（3, 4-dihydroxy-acetophenone）。

圖1 化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

化合物2：無色油狀物（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）給出了2個芳香質(zhì)子信號δ 6.51（2H，s，H-2，6）和3個甲氧基信號δ 3.73（6H，s，3，5-OCH3），3.13（3H，s，7-OCH3），此外還有2個次甲級和1對亞甲基信號δ 3.99（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），3.48（1H，m，H-8），3.23（1H，dd，J=10.8，4.0 Hz，H-9a），3.09 （1H，dd，J=10.8，6.1 Hz，H-9b）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）共給出了12個碳信號δ 129.5（C-1），104.7（C-2，6），147.7（C-3，5），134.8（C-4），84.1（C-7），75.1（C-8），62.5（C-9），55.9（3，5-OCH3），56.3（7-OCH3）。與文獻(xiàn)[7]對比分析，鑒定化合物2為thero-8S-7-methoxysyringylglycerol。

化合物3：白色無定形粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）中δ 7.34 （2H，s，H-2，6）為芳香質(zhì)子信號，δ 5.14（1H，dd，J=5.0，4.0 Hz，H-2’），3.87 （1H，dd，J=11.6，4.0 Hz，H-3’a），3.75（1H，dd，J=11.6，5.0 Hz，H-3’b）為連氧氫信號，δ 3.91（6H，s，2 × OCH3）為2個甲氧基信號。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）給出碳信號δ 126.7（C-1），107.7（C-2，6），149.1（C-3，5），199.7（C-1’），75.5（C-2’），66.2（C-3’），56.9（2 × OCH3）。對比文獻(xiàn)[8]，鑒定化合物3為2, 3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)-1-propanone。

化合物4：白色粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）中給出一組芳香質(zhì)子信號：δ 7.05（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.96（1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6），6.78 （1H，d，J=8.2 Hz，H-5），組成ABX自旋耦合系統(tǒng)，提示結(jié)構(gòu)中存在1,3, 4三取代苯環(huán)；3個不飽和雙鍵信號：δ 7.57（1H，d，J=15.9 Hz，H-1’），6.28（1H，d，J=15.9 Hz，H-2’），5.71（1H，br.t，J=6.9 Hz，H-5’）；2個亞甲基信號：δ 4.61（2H，br.s，H-4’），4.45（1H，d，J=12.0 Hz，H-7’a），4.28（1H，d，J=12.0 Hz，H-7’b）；1個甲基信號：δ 1.76（3H，s，H-1’’）；以及一個糖端基質(zhì)子信號：δ 4.32（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-H-1）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）譜中給出20個碳信號，其中一個酯羰基信號δ 168.9（C-3’）；10個不飽和碳信號δ 127.7（C-1），114.9（C-2），146.8（C-3），149.7（C-4），116.5（C-5），123.0（C-6），147.2（C-1’），115.2（C-2’），125.0（C-5’），135.9（C-6’）；一組葡萄糖碳信號δ 103.3（Glc-1），75.1（Glc-2），78.0 （Glc-3），71.7（Glc-4），78.1（Glc-5），62.8（Glc-6）；2個連氧亞甲基碳信號δ 66.1（C-4’），69.7（C-7’） 和1個甲基信號δ 14.2（C-1’’）。綜合以上數(shù)據(jù)，查詢文獻(xiàn)[9]，鑒定化合物4為caffeic acid(1-hydroxyl-4-O-β-D-glucopyranosylprenyl)-ester。

化合物5：無色針晶（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，pyridine-d5）：δ 6.30（1H，d，J=7.6 Hz，Glc-H-1），5.59（1H，br.s，H-12），1.66（3H，s，29-CH3），1.42（3H，s，24-CH3），1.24（3H，s，26-CH3），1.08（3H，s，27-CH3），1.05（3H，s，25-CH3），1.09（3H，d，J=6.5 Hz，30-CH3）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）給出36個碳信號，其中30個為三萜母核碳信號δ 39.6（C-1），27.4（C-2），73.8（C-3），43.3（C-4），49.5（C-5），19.3（C-6），33.6（C-7），41.2（C-8），48.0（C-9），37.9（C-10），24.7（C-11），129.7（C-12），139.6（C-13），42.7（C-14），29.7（C-15），26.5（C-16），49.1（C-17），55.0（C-18），73.6（C-19），42.9（C-20），27.1（C-21），38.3（C-22），67.5（C-23），12.7（C-24），17.6（C-25），16.6（C-26），24.7（C-27），177.3 （C-28），27.2（C-29），16.3（C-30），剩余6個為葡萄糖信號δ 95.8（Glc-1），74.0 （Glc-2），78.6（Glc-3），71.1（Glc-4），78.3（Glc-5），62.4（Glc-6）。查閱文獻(xiàn)[10]對比以上數(shù)據(jù)，鑒定化合物5為長梗冬青苷（pedunculoside）。

化合物6：白色無定形粉末（甲醇）。與化合物5相似，13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）同樣給出36個碳信號，30個為三萜母核碳信號δ 39.2（C-1），28.8（C-2），80.6（C-3），43.5（C-4），56.8（C-5），19.6（C-6），34.2（C-7），40.9（C-8），48.2（C-9），37.4（C-10），24.6（C-11），128.6（C-12），139.6（C-13），42.5（C-14），29.6（C-15），26.4（C-16），49.0（C-17），54.8（C-18），73.0（C-19），42.4（C-20），27.0（C-21），38.0（C-22），23.9（C-23），64.9（C-24），16.5（C-25），17.6（C-26），24.9（C-27），177.3（C-28），27.4（C-29），17.0（C-30），及6個葡萄糖信號δ 96.2 （Glc-1），74.4（Glc-2），79.6（Glc-3），71.5（Glc-4），79.3（Glc-5），62.8（Glc-6）。綜合比較可發(fā)現(xiàn)，化合物5和6為同分異構(gòu)體，二者的區(qū)別僅僅在于23，24位羥基的位置，根據(jù)相關(guān)報道[108]：當(dāng)24位為-OH時，對應(yīng)的13C-NMR化學(xué)位移值分別為δ 23.5（C-23）/64.5（C-24）；當(dāng)23位為-OH時，其對應(yīng)的13C-NMR化學(xué)位移值分別為δ 67.9（C-23）/12.8（C-24）。因此將以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]比較，鑒定化合物6為rotungenoside（ilexoside XXXV）。

化合物7：無色針晶（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，pyridine-d5） 給出一個不飽和雙鍵氫信號δ 5.64（1H，br.s，H-12），和6個甲基信號δ1.71（3H，s，29-CH3），1.46（3H，s，24-CH3），1.15（3H，s，26-CH3），1.14（3H，d，J=6.7 Hz，30-CH3），1.08（3H，s，27-CH3），1.02（3H，s，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5） 給出30個碳信號，δ 39.2 （C-1），28.0 （C-2），73.9（C-3），43.2（C-4），49.0（C-5），19.1（C-6），33.6（C-7），40.7（C-8），48.1（C-9），37.5（C-10），24.4（C-11），128.4（C-12），140.3（C-13），42.4（C-14），29.6（C-15），26.7（C-16），48.6（C-17），54.9（C-18），73.0（C-19），42.7（C-20），27.3（C-21），38.8（C-22），68.4（C-23），13.4（C-24），17.6（C-25），17.1（C-26），25.0（C-27），181.0（C-28），27.4 （C-29），16.3（C-30）。對比NMR數(shù)據(jù)并查閱文獻(xiàn)[12]發(fā)現(xiàn)該化合物為長梗冬青苷的苷元，因此鑒定化合物7為救必應(yīng)酸（rotundic acid）。

化合物8：白色無定形粉末（甲醇）。13C-NMR（100 MHz，pyridine-d5）：δ 39.1 （C-1），28.8（C-2），80.6（C-3），43.6（C-4），56.8（C-5），19.6（C-6），34.3（C-7），40.8（C-8），48.2（C-9），37.5（C-10），24.6（C-11），128.3（C-12），140.4（C-13），42.5（C-14），29.7（C-15），26.8（C-16），48.7（C-17），55.0（C-18），73.1（C-19），42.8（C-20），27.3（C-21），38.9（C-22），24.0（C-23），65.0（C-24），16.4（C-25），17.5（C-26），25.0（C-27），181.0（C-28），27.5（C-29），17.2（C-30），以上數(shù)據(jù)與化合物7基本一致，同樣是23，24位羥基的位置不同。查閱文獻(xiàn)[13]比較后，鑒定化合物8為救必應(yīng)酸的同分異構(gòu)體rotungenic acid。