枸杞根腐病菌拮抗菌株的篩選與鑒定

張小彥，何 靜，侯彩霞，張樹(shù)衡

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

枸杞(Lyciumbarbarum)屬于茄科枸杞屬落葉木本多刺灌木，能承受-15～40 ℃的極端環(huán)境溫度。枸杞屬植物約有70種，分布于歐亞大陸、北美、南美、南非和澳大利亞的溫帶至亞熱帶的不同區(qū)域[1-2]，在我國(guó)則主要分布在川北、華北北部、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海和新疆等地[3]。枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，且含有多種生物活性化合物，如多糖、礦物質(zhì)、類胡蘿卜素和多酚類化合物，具有抗癌、減肥、抗衰老、抗糖尿病、抗腎臟和肝臟疾病等多種益處[4]，因而被譽(yù)為“超級(jí)食品”，越來(lái)越受到人們的青睞[5]。

近幾年，甘肅省枸杞種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，現(xiàn)階段枸杞栽培面積超過(guò)2萬(wàn)hm2，而枸杞病害的發(fā)生也逐年加重，防控難度進(jìn)一步加大[6]，其中枸杞根腐病是最主要的病害之一[7]。研究顯示，腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)常引起系統(tǒng)性病害的發(fā)生[8-9]，是甘肅枸杞根腐病的主要致病菌之一[10]，病菌一般自傷口或表皮侵入[11]，使枸杞在整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)病，且發(fā)病情況與氣候條件、灌水和栽培方式均有關(guān)系，一般情況下6月中旬發(fā)病，盛期在7—8月[12]。發(fā)病時(shí)，患病植株葉片發(fā)黃，枝條萎縮，造成枸杞品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全株枯死，給當(dāng)?shù)罔坭椒N植戶帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。

目前，對(duì)枸杞根腐病的防治主要以化學(xué)藥劑為主。前人研究發(fā)現(xiàn)，噁霉·福美雙[14]、代森銨[7]、咯菌腈[13]等不同供試殺菌劑對(duì)枸杞根腐病病菌菌絲生長(zhǎng)均有明顯的抑制效果。然而，化學(xué)藥劑的大量使用不但造成生產(chǎn)成本增加，最重要的是引起耐藥病原體的出現(xiàn)[15-16]，且化學(xué)農(nóng)藥會(huì)對(duì)環(huán)境和生態(tài)平衡產(chǎn)生不利影響，并通過(guò)生物富集作用對(duì)人畜健康造成潛在威脅[17]。生防菌因在改善土壤環(huán)境、控制病害中所表現(xiàn)出來(lái)的效果好、成本低、效率高、環(huán)境友好和無(wú)藥物殘留等特點(diǎn)，而日益受到關(guān)注[18-19]。但受各種因素的制約，尤其是外界環(huán)境對(duì)生防菌的活性影響，導(dǎo)致防效穩(wěn)定性不高。因而，獲得防效穩(wěn)定的生防菌株，利用微生物對(duì)枸杞根腐病進(jìn)行防治，顯得至關(guān)重要[20]。目前，利用根際拮抗菌防治枸杞根腐病的研究還鮮有報(bào)道。本研究從健康枸杞植株根際采取土樣，從中分離、篩選對(duì)枸杞根腐病菌F.solani具有拮抗作用的菌株，為有效利用土壤微生物防治枸杞根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，菌種于PDA培養(yǎng)基試管斜面中生長(zhǎng)，4 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

拮抗菌株的分離以及供試菌種的純化采用PDA培養(yǎng)基和蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集方法

土壤采自甘肅省景泰縣2年生枸杞種植園中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的健康枸杞根際。采用5點(diǎn)取樣法，鏟去樹(shù)體表層土，挖取地表下約 10～15 cm 處的土壤，裝入無(wú)菌自封袋，快速帶回實(shí)驗(yàn)室置于報(bào)紙上自然風(fēng)干，備用。

1.2.2 土壤微生物的分離純化

將自然風(fēng)干后的土壤過(guò)20目篩，稱取5 g置于預(yù)先準(zhǔn)備好的三角瓶中，加入45 mL無(wú)菌水及適量玻璃珠，振蕩20 min，得到土壤樣品懸液，依次用無(wú)菌水配置成3個(gè)濃度梯度的土壤懸液(10-7、10-8、10-9)，每個(gè)梯度取100 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基的表面上，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于25 ℃下培養(yǎng)3～5 d，挑取性狀差異明顯的單菌落進(jìn)行編號(hào)，劃線法純化培養(yǎng)[21-23]。

1.2.3 拮抗菌的篩選

采用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌株。先在PDA平板上活化腐皮鐮孢菌，用打孔器取5 mm的菌餅置于培養(yǎng)基的一側(cè)，距平板邊緣3 cm處對(duì)稱接種已純化的土壤微生物單株菌株，每個(gè)處理重復(fù)3～5次，25 ℃培養(yǎng)，5～7 d后觀察其抑菌作用。然后分別計(jì)算高活性拮抗菌株對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制率。

抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑))×100%。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：主要包括菌落的大小、顏色、菌落的形態(tài)等方面。

分子生物學(xué)鑒定：將原始菌擴(kuò)大培養(yǎng)后利用 TIANGEN DNA KIT 提取原始菌基因組 DNA?；蛴靡埔浩魑∩倭烤?，加入適量的 1%的 SDS 沸水煮 10 min(酵母在堿性條件下，高溫度下其細(xì)胞壁更容易破碎)，吸入適量基因組 DNA 或破碎產(chǎn)物，Taq酶，dNTP及反應(yīng)所需的引物(該引物為通用生物合成)：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R (5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3 ′)；ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系(總體系 50 μL)包括：26 μL Mix 酶包含(Taq酶1 μL，DNTP 10 μL，Buffer 15 μL)，21 μL H2O，1 μL模板，1 μL FORWARD-WANGXUE引物，1 μL REVERSE-WANGXUE引物，然后進(jìn)行測(cè)序?qū)嶒?yàn)，根據(jù)所得到測(cè)序目的序列到 NCBI 進(jìn)行Blast比對(duì)。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，1%的瓊脂糖鑒定，并使用 Axygen 凝膠回收試劑盒回收所需 PCR 產(chǎn)物片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤微生物的分離菌株數(shù)

由表1可知，采集的土樣中共計(jì)分離到101株細(xì)菌、52株放線菌、30株霉菌和27株酵母菌。其中，當(dāng)根際土壤的濃度稀釋為10-7時(shí)，較于土壤的濃度稀釋為10-8和10-9，分離效果明顯，分離出的微生物種類偏多。

2.2 拮抗菌株的篩選

表1 不同根際土壤稀釋濃度分離到的菌株數(shù)

Table 1 Number of strains isolated from different concentrations of rhizosphere soil samples

濃度Concentration細(xì)菌Bacteria放線菌Actinomycetes霉菌Mycetes酵母菌Saccharomycetes10-715502117731895610-81236796001195110-98257105117610合計(jì)Total101523027

從分離得到的101株細(xì)菌、52株放線菌、30株霉菌和27株酵母菌中篩選得到2株對(duì)腐皮鐮孢菌具有明顯抑制作用的菌株，分別為HYM19(圖1-A)和HYC7(圖1-B)，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的抑制帶。

2.3 拮抗菌株對(duì)腐皮鐮孢菌的抑制效果

PDA平板對(duì)峙結(jié)果顯示，菌株HYM19和菌株HYC7對(duì)腐皮鐮刀菌均有顯著的拮抗效果，且HYM19的抑菌率為52.29%，菌株HYC7的抑菌率為39.80%，菌株HYM19的抑菌率比菌株HYC7的抑菌率高12.49百分點(diǎn)(表2)。

2.4 拮抗菌株HYM19和HYC7形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌HYM19菌落(圖2-A)呈花瓣?duì)睿砻嬗旭薨櫷黄?、有黏液，濕?rùn)、黏稠、易挑取、質(zhì)地均勻，菌落正反面或邊緣與中央部位顏色一致，邊緣一般看不到細(xì)胞，與培養(yǎng)基不結(jié)合，菌落外觀形態(tài)小而凸起，生長(zhǎng)速度較慢。真菌HYC7(圖2-B)菌落初期出現(xiàn)白色絨毛狀，培養(yǎng)至后期整個(gè)菌落被綠色分生孢子覆蓋；在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲分支、有隔、無(wú)色光滑，分生孢子梗與菌絲近似，在其末端產(chǎn)生瓶狀單個(gè)或多個(gè)小梗；分生孢子呈念珠狀，較對(duì)稱(圖3)。

圖1 HYM19(A)和HYC7(B)產(chǎn)生的抑菌帶Fig.1 The bacteriostatic zone produced by HYM19(A) and HYC7(B)

表2 拮抗菌株對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制效果

Table 2 Inhibitory effect of antagonistic strains onFusariumsolani

菌株編號(hào)Strainnumber處理組菌落直徑Colony diameter ofcontrol group/mm抑菌率Inhibitionrate/%對(duì)照Control60.00±1.37 a—HYM1931.24±0.74 c52.29HYC738.11±1.39 b39.80

同列數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

The values in the same column followed by different letters showed the significant difference(P<0.05).

圖2 HYM19(A)和HYC7(B)菌落形態(tài)Fig.2 Strain morphology of HYM19(A) and HYC7(B)

16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，從枸杞健康土壤中分離的HYM19菌株和HYC7菌株與已知模式屬的最大相似性均在98%以上，說(shuō)明新分離內(nèi)生菌的科學(xué)分類地位比較明確(圖4、圖5)。

瓊脂糖凝膠電泳(圖6)顯示，HYM19菌株的ITS-PCR產(chǎn)物在1 000 bp附近處出現(xiàn)條帶，測(cè)序后得到其ITS序列長(zhǎng)為1 359 bp。通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，與中華根瘤菌屬相似性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，鑒定其為中華根瘤菌屬Sinorhizobium。HYC7菌株的ITS-PCR產(chǎn)物在500 bp附近處出現(xiàn)條帶，測(cè)序后得到其ITS序列長(zhǎng)為553 bp。通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，與綠僵菌屬相似性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，鑒定其為綠僵菌屬M(fèi)etarhizium。

標(biāo)尺=20 μm。Bars=20 μm.圖3 HYC7孢子形態(tài)(A)、菌絲形態(tài)(B)及產(chǎn)孢梗和分生孢子(C)Fig.3 Spore morphology (A)， mycelial morphology (B) and conidiophores and conidia (C) of HYC7

圖4 菌株HYC7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain HYC7

圖5 菌株HYM19的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain HYM19

圖6 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.6 Agar gel electrophoresis

3 討論與結(jié)論

枸杞根腐病是一種危害極其嚴(yán)重的土傳病害，嚴(yán)重時(shí)枝條或全株枯死，極具毀滅性[24]。 隨著枸杞種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生情況直接影響到地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民增收[25]。目前生物防治代替化學(xué)防治土傳病害是未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要措施，而生防菌的篩選則是開(kāi)展生防病害的技術(shù)核心和關(guān)鍵[26]。具有生防活性的微生物菌株篩選于自然界，對(duì)環(huán)境無(wú)污染殘留，是一種環(huán)境友好的生物防治新手段[27]。生防菌主要通過(guò)分泌抗性物質(zhì)、空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的方式抑制植物病害，其中具有多重作用方式的拮抗菌株在病害防治中具有更好的應(yīng)用潛力[28]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展，化學(xué)肥料與農(nóng)藥的大量使用，使得土壤肥力顯著下降，環(huán)境質(zhì)量與人類健康以及生態(tài)平衡受到極大威脅。充分利用各種可再生生物資源，是解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境問(wèn)題以及經(jīng)濟(jì)效益與環(huán)境代價(jià)之間矛盾的根本途徑。生物防治有助于改善土壤理化性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物健康水平，增強(qiáng)寄主植物的抗病能力；利用生防細(xì)菌、真菌及放線菌等拮抗微生物的寄生、抗生作用，及其與病原菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)抑制和消滅病原菌；誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生對(duì)病原菌的系統(tǒng)抗性[29-31]。

近年來(lái)應(yīng)用拮抗菌及其代謝物防控作物真菌病害的研究時(shí)有報(bào)道。例如孫冬梅等[32]發(fā)現(xiàn)黃綠木霉菌(Trichodermaaureoviride)對(duì)大豆根腐病鐮孢菌具有良好的抑制作用。勾長(zhǎng)龍等[33]從人參根際土壤中篩選得到一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)HB-3，能顯著抑制人參根腐病菌的生長(zhǎng)，對(duì)人參根腐病有較強(qiáng)的生物防治效果。黃銘慧[34]從大豆根際土壤中篩選出一株具有較強(qiáng)抑菌效果的生防細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

本研究從健康枸杞根際土壤中分離得到101株細(xì)菌、52株放線菌、30株霉菌和27株酵母菌，其中對(duì)枸杞致病菌F.solani有明顯抑制效果的菌株有2株，分別鑒定為綠僵菌Metarhizium和中華根瘤菌屬Sinorhizobium。綠僵菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用報(bào)道較少，現(xiàn)有報(bào)道以金龜子綠僵菌為主。齊永霞等[35-36]研究表明，金龜子綠僵菌Ma55菌株對(duì)3株枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率均超過(guò)了70%。楊帆等[37]首次以平沙綠僵菌菌株為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)大豆根腐病菌尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)等7株植物病原菌均有不同程度的抑制作用，都可以產(chǎn)生抑菌帶。李云玲等[38]發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉根際微生物草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)CHW10B的溶磷特性及促生作用。為了更充分地利用并發(fā)揮根瘤菌的作用，今后的研究需要致力于加強(qiáng)根瘤菌與植物的相互作用機(jī)理研究，篩選優(yōu)良菌種，從環(huán)境因素、基因表達(dá)以及基因與環(huán)境相互作用的角度，深入研究根瘤菌的遺傳多樣性以及生態(tài)特性，這也是未來(lái)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的方向之一[39-40]。

本實(shí)驗(yàn)證明分離出的兩種內(nèi)生菌均對(duì)枸杞根腐病害生物防治領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力，后續(xù)將深入探索上述菌株對(duì)枸杞根腐致病菌的抑菌作用機(jī)制，結(jié)合田間病害防效測(cè)定，為枸杞病害生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于植物病害的生物防治研究已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，然而在實(shí)踐中仍存在諸多問(wèn)題。生防微生物資源雖然豐富但能用于作物生產(chǎn)的制劑或產(chǎn)品的種類和數(shù)量十分有限，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要；許多生防產(chǎn)品的作用機(jī)理尚不明確，導(dǎo)致室內(nèi)抑菌試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的防治效果差異較大；最重要的是由于外界因素導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定[18]。因此，后期有必要對(duì)拮抗菌株的抗菌機(jī)理以及制備穩(wěn)定的生防菌株進(jìn)行更加深入的研究。