杧果品種親緣關系的CDDP分析

張 宇，張 繼，榮 濤，歐克緯，黃國弟，宋紅霞

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

杧果(MangiferaindicaL.)是熱帶亞熱帶以及干熱河谷地區(qū)主要栽培果樹[1-4]。隨著國內生活水平的提高，消費者對杧果品質的要求也不斷提升，杧果新品種選育顯得尤為重要[5-7]。以植物分子生物技術進行杧果遺傳多樣性分析和種質鑒定可為新品種選育提供參考依據(jù)。目前，RAPD[8]、ISSR[2，4，9-10]、SRAP[11-12]和AFLP[13]等傳統(tǒng)分子標記成功用于杧果種質鑒定、親本選配以及遺傳親緣距離分析等。但這些標記隨機性太強，往往偏離目標性狀基因。帶有目標性的分子標記技術成為當下分子標記應用的熱點[14]。

保守DNA衍生多態(tài)性(conserved DNA-derived polymorphism，CDDP)分子標記的誕生豐富了目標性分子標記的選擇范圍，其原理是依據(jù)植物中基因家族或功能基因中保守堿基序列設計單引物，實現(xiàn)快捷鑒定植物種內、種間的分子標記手段。通過PCR技術擴增得到的堿基序列很有可能是基因的一部分或與基因緊密連鎖，標記呈顯性，具有豐富的多態(tài)性，可用瓊脂糖凝膠電泳分離，擴增條帶多，穩(wěn)定性好。與ISSR等隨機分子標記相比，CDDP分子標記目標性更強，且具有操作易、成本低、精準高等優(yōu)勢。采用CDDP分子標記進行種質資源鑒定、親緣關系研究以及分子鋪助育種意義深遠[15-17]，目前尚未見相關研究報道。本研究以杧果作為研究對象，利用CDDP標記技術進行遺傳親緣關系分析，為豐富杧果分子輔助育種技術手段提供借鑒和參考素材。

1 材料與方法

1.1 材料

31個杧果品種來自于廣西亞熱帶作物研究所資源圃(表1)，選取完整無任何損害的磚紅色嫩葉作為供試材料[3]。供試材料處理保存、DNA提取檢測參考張宇等[1]的方法。

表1 供試杧果種質材料

Table 1 Mango materials used in this study

編號No.品種Variety原產地Source編號No.品種Variety原產地Source編號No.品種Variety原產地Source1粵西1號Yuexi No.1中國廣東Guangdong, China12緬甸球芒Miandianqiumang緬甸Burma22海頓Haidun美國America2金穗芒Jinsuimang中國廣西Guangxi, China13椰香Yexiang印度India23湯米Tangmi美國America3白象牙Baixiangya泰國Thailand14紫花芒Zihuamang中國廣西Guangxi, China24留香Liuxiang斯里蘭卡Sri Lanka4桂熱71號Guire No.71中國廣西Guangxi, China15桂熱芒10號Guiremang No.10中國廣西Guangxi, China25吉爾Jier美國America5沅江象牙Yuanjiangxiangya中國云南Yunnan, China16桂熱芒120號Guiremang No.120中國廣西Guangxi, China26生食芒Shengshimang泰國Thailand6四季芒Sijimang泰國Thailand17玉文Yuwen臺灣Taiwan27呂宋芒Lvsongmang菲律賓Philippines7三年芒Sannianmang中國云南Yunnan, China18愛文Aiwen美國America28金白花Jinbaihua泰國Thailand8鷹嘴芒Yingzuimang印度尼西亞Indonesia19凱特芒Kaitemang美國America29龍眼香芒Longyanxiangmang中國四川Sichuan, China9桂香芒Guixiangmang中國廣西Guangxi, China20金煌芒Jinhuangmang臺灣Taiwan30R2E2澳大利亞Australia10秋芒Qiumang印度India21貴妃芒Guifeimang臺灣Taiwan31馬切蘇Maqiesu緬甸Burma11串芒Chuanmang中國廣西Guangxi, China

1.2 杧果CDDP-PCR擴增與檢測

參考已公布的21條通用型CDDP引物，篩選擴增效果較好的若干條引物用于杧果CDDP-PCR擴增[18]。引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增反應程序和PCR體系各組分濃度參考張宇等[3]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

計算擴增條帶(number of bands，N)、多態(tài)性條帶(number of polymorphic bands，NPB)、多態(tài)性條帶比率(polymorphism rate，PPB)、等位基因數(shù)(average allele number，Na)、有效等位基因數(shù)(effective allele number，Ne)、Nei’s基因多樣度(Nei’s gene diversity，H)和Shannon信息指數(shù)(Shannon information index，I)等遺傳多樣性指標；聚類分析參考李永濤等[19]的方法；主成分分析和PCA圖構建參考陳宗游等[20]的方法。

2 結果與分析

2.1 杧果CDDP-PCR引物選擇及擴增

目前已經公布的21條CDDP引物均可用于杧果CDDP-PCR擴增，遵循節(jié)約高效原則選出8條引物(表2)對31個杧果品種進行擴增。8條引物共擴增出條帶(N)107條，平均條帶13條。其中多態(tài)性條帶(NPB)100條，平均條帶12條。多態(tài)性條帶比率(PPB)在84.62%～100%，平均為93.57%，除MADS-3引物外，其他引物擴增結果多態(tài)性條帶比率均≥91.67%，ERF1引物效率最高。每個位點的平均等位基因數(shù)(Na)為1.847 1，每個位點的平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.636 8，Nei’s平均基因多樣性(H)為0.410 8，Shannon平均信息指數(shù)(I)為0.84。

以MYB1引物為例，對31個杧果品種進行CDDP擴增分析，其擴增條帶整潔、清晰、層次分明、差異性豐富(圖1)。擴增條帶多數(shù)集中在500～2 000 bp，多態(tài)性條帶比率高達93.33%。

2.2 聚類分析

利用UPGMA軟件對31個供試杧果品種進行聚類分析(圖2)，在遺傳相似系數(shù)0.690 6處，供試杧果品種被分為7大類，Ⅰ類群包括粵西1號、金穗芒、白象牙、桂熱71號、沅江象牙、四季芒和三年芒，分別來自中國廣西、廣東、云南和泰國，遺傳相似系數(shù)為0.793 6～0.904 8；Ⅱ類群包括鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香芒，分別來自印度尼西亞、中國廣西、緬甸和印度，遺傳相似系數(shù)為0.733 3～0.890 4；Ⅲ類群包括紫花芒、桂熱芒10號和桂熱芒120號，全部來自中國廣西，遺傳相似系數(shù)為0.872 8～0.906 4；Ⅳ類群包括玉文、愛文、凱特芒、金煌芒、貴妃芒、海頓、湯米、留香和吉爾，分別來自美國、中國臺灣和斯里蘭卡，遺傳相似系數(shù)為0.704 8～0.890 3；Ⅴ類只有生食芒和呂宋芒，在遺傳相似系數(shù)為0.871 2處可區(qū)分，生食芒來自泰國，呂宋芒來自菲律賓；Ⅵ類包括金白花、龍眼香芒和R2E2，分別來自泰國、中國四川和澳大利亞，遺傳相似系數(shù)為0.765 6～0.834 4；Ⅶ類只有馬切蘇。由聚類樹狀圖分析可知：31個杧果品種間遺傳信息豐富，種間具有較高的遺傳差異，說明CDDP分子標記可為杧果品種的親緣關系研究提供較多的數(shù)據(jù)量。但CDDP標記不能將來源地一致的杧果品種聚類在一起，表明杧果有可能存在較為復雜的遺傳親緣關系，而地理隔離較弱。

表2 八條引物擴增的CDDP條帶結果

Table 2 Amplification bands with eight of CDDP primer

引物名稱PrimerNNPBPPB/%NaNeHIWRKY-F1161593.751.89401.65200.43530.86MYB1151493.331.88161.64230.42560.85MYB2131292.31184231.63250.40550.81ERF113131001.86251.65250.41650.88ERF3141392.861.87501.66290.42400.89MADS-111111001.79901.59500.38500.80MADS-2121191.671.80021.62330.39600.82MADS-3131184.621.82251.63350.39820.83平均Average131293.571.84711.63680.41080.84總計Total107100

M，DL2000 DNA marker。圖1 MYB1引物的杧果CDDP-PCR擴增圖Fig.1 Mango CDDP-PCR amplification of MYB1 primer

2.3 主成分分析

基于CDDP標記對31個杧果品種繪制主成分分析二維PCA圖(圖3)。PCA圖中杧果品種位置分布的聚散、遠近代表品種之間的親緣關系，與聚類分析結果對比，其親緣關系基本一致，但也有不同。聚類分析結果顯示，粵西1號、金穗芒、白象牙、桂熱71號、沅江象牙、四季芒和三年芒聚類在一組，但PCA圖結果顯示，四季芒與其他6個杧果品種親緣關系較遠，該組中四季芒原產地為泰國，聚類分析不能較好地區(qū)分出杧果品種間地理隔離的差異，但主成分分析可以將部分存在地理隔離的杧果品種區(qū)分開來；聚類分析可將鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香聚為一類，但主成分分析結果顯示，椰香與愛文、

材料編號對應的具體材料名稱見表1。下同。Material number was the same as that shown in Table 1. The same as below.圖2 三十一個杧果品種聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis tree of 31 mango varieties

圖3 三十一個杧果品種主成分分析Fig.3 Principal component analysis of 31 mango varieties

凱特親緣關系更近，有可能是不同的親緣關系分析軟件和方法側重考量的信息分析數(shù)據(jù)不一樣導致分析結果有差異。聚類分析不能將來源地一致的杧果品種聚類在一起，但主成分分析卻能將來源地一致的部分品種區(qū)分開來，表明主成分分析可以更直觀地體現(xiàn)杧果品種間的遠近，既可以體現(xiàn)聚類分析類別內的緊密親緣關系，也可以體現(xiàn)類別間親緣關系的疏離程度。

3 討論與結論

杧果的遺傳多樣性是新品種推陳出新的不竭動力[21]。CDDP為一種新型高效分子標記技術，可以獲得豐富的遺傳信息反映物種間的親緣關系[22-23]。本實驗利用8條CDDP通用引物，在31個杧果品種上可以得到多態(tài)性豐富，層次分明的電泳圖譜，如圖1所示，表明CDDP技術可重復、高效地對不同杧果品種進行遺傳分析。8條引物共擴增出107條帶，其中多態(tài)性條帶100條，平均多態(tài)性比率(PPB)為93.57%，多態(tài)性豐富，每個位點的平均等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)分別為1.847 1、1.636 8、0.410 8、0.84，說明杧果品種間具有較為復雜豐富的遺傳背景。采用不同的分子標記技術以及供試品種的不同、數(shù)量的不同得出的多態(tài)性也存在差異，這符合杧果高度異花授粉、種子高度雜合且生命周期較長的特點，具備了較為豐富的遺傳多樣性特性。

對31個杧果品種進行聚類分析和主成分分析反映出的品種間親緣關系基本一致，但也有不同。聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.690 6處，31個杧果品種可以分成7大類。31個杧果品種相似系數(shù)為0.620 6～0.920 8，說明杧果品種間遺傳親緣關系緊密聯(lián)系，卻又差異多樣豐富。主成分分析較聚類分析可更直觀地反映不同品種間的親緣關系，但由于分析依據(jù)不同、側重不同，分析結果也略有不同。如：采用聚類分析方法可以得出粵西1號、金穗芒、白象牙、桂熱71號、沅江象牙、四季芒和三年芒具有較近的親緣關系，但主成分分析方法得出結果顯示四季芒與其他6個杧果品種親緣關系較遠；聚類分析可將鷹嘴芒、桂香芒、秋芒、串芒、緬甸球芒和椰香聚為一類，但主成分分析結果顯示，椰香與愛文、凱特親緣關系更近。對比兩種分析方法發(fā)現(xiàn)，聚類分析法不能將來源地一致的杧果品種聚為一類，也不能將來源地不一致的杧果品種區(qū)分開來，主成分分析法可以將來源地不一致的部分杧果品種區(qū)分開來，但沒有顯示出來源地一致的杧果品種親緣關系較近。這有可能是供試的部分杧果品種帶有鮮明的獨特遺傳特性，恰好主成分分析側重的考量依據(jù)可以將這樣的杧果品種劃分出新的親緣關系。受科研技術所限，以往涉及物種遺傳多樣性的研究往往只采用聚類分析法，如今主成分分析法的大量應用為品種鑒別、分子遺傳育種提供了更多的參考依據(jù)，豐富了研究結果，也更加夯實了利用分子生物學服務農業(yè)應用的實踐基礎。

本實驗所選取的供試杧果品種與應東山等[24]利用ISSR標記進行杧果種質資源遺傳分析的部分杧果品種一致，通過聚類分析可知CDDP和ISSR標記技術可以得出較為相似的遺傳多樣性分析結果，印證了CDDP標記在杧果種質資源鑒定中應用的可靠性。但也存在不一致的情況，如四季芒的遺傳情況有所不同，可能是因為CDDP和ISSR標記技術的原理不同造成其分析結果不同。ISSR是隨機標記，引物多，操作簡單，適合進行大批量供試材料的遺傳多樣性分析，但其引物均為隨機引物，不能錨定目的基因序列，往往帶有很強的隨機性；而CDDP標記雖然其引物不及ISSR標記引物數(shù)量多，但其引物設計是依據(jù)植物材料中特有的保守序列進行引物設計，而這些保守序列通常存在于一些功能基因以及基因家族中。因此，CDDP標記即具有適用于植物材料研究的普遍性，又具有目的功能基因的靶向性。以上研究表明，CDDP適用于杧果遺傳多樣性研究，并且優(yōu)于ISSR等隨機標記，可以矯正隨機標記結果的盲區(qū)。