基于葉片質外體相關成分和酶活性響應的龍葵耐Cd機理研究

王小明，陳愛玲，董 璐，石玉軍，鄭劉長，趙連慧，張瑞琪，張芬琴，*

(1.河西學院 生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000； 2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

龍葵(SolanumnigrumL.)是一年生草本植物，喜生于田邊、荒地及村莊附近，莖直立，多分枝，卵形或心型葉子互生，小花白色，4～10朵成聚傘花序，漿果球形，成熟后為黑紫色。漿果和葉子均可食用。全株入藥，可散瘀消腫，清熱解毒[1]。然而，研究也發(fā)現(xiàn)龍葵具有重金屬Cd超積累特性[2]，對Cd有較好的耐性，這不僅對其藥性發(fā)揮有影響，而且通過食物鏈或用藥對人體健康產(chǎn)生危害。因此，探討Cd積累于龍葵植物的影響有助于其藥用質量的提高和綠色生產(chǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，Cd在細胞壁中沉積是水稻的關鍵耐Cd機制[3]，細胞壁對Cd具有較高的吸附固定能力，是小飛蓬耐Cd的一種重要機制[4]等。也有研究認為，進入植物細胞的Cd誘導活性氧如H2O2產(chǎn)生，細胞內的抗氧化酶系統(tǒng)能將后者清除，且Cd耐性較強的箭舌豌豆質外體汁液中抗氧化酶活性高于Cd敏感品種綠豆質外體汁液中的[5]等等。細胞壁和質外體汁液均屬植物組織質外體的組成成分。龍葵細胞壁結構成分及細胞壁結合酶、質外體汁液相關成分及抗氧化酶系統(tǒng)對Cd有何響應、在龍葵Cd耐性中發(fā)揮什么樣的作用，目前未見相關報告。為此，選取龍葵(SolanumnigrumL.)為實驗材料，以葉片質外體組分細胞壁和質外體汁液為對象，研究細胞壁結構成分及結合酶和質外體汁液中抗氧化酶系統(tǒng)對較長時間Cd暴露的響應，以探討其在龍葵Cd耐性中的作用，為全面闡明植物Cd耐性機理提供直接證據(jù)，為藥用龍葵的綠色生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

龍葵(SolanumnigrumL.)種子采自北緯38°56′39″、東經(jīng)100°26′34″的甘肅省河西走廊中部張掖市甘州區(qū)城郊農(nóng)田。挑選飽滿、大小一致的龍葵種子，用0.1%HgCl2溶液進行2 min的表面消毒，之后浸種12 h，將吸足水分的種子播于墊有5層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，播好后將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱于黑暗條件下使其萌發(fā)，萌發(fā)的種子播種至口徑10 cm大、裝有蛭石的育苗缽中，每穴3粒，共6穴，加入完全營養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度為白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照強度為553 μmol·m-2·s-1，濕度為65%。待長出5片真葉后，間苗至每缽6株苗后于完全營養(yǎng)液中加入50 μmol·L-1Cd(CdCl2·2.5H2O)進行Cd處理培養(yǎng)，以不加Cd的營養(yǎng)液作為對照，設3次重復，培養(yǎng)條件如前述。培養(yǎng)120 d后，采樣測定相關指標。

1.2 方法

1.2.1 生長及光合指標測定

根長、莖長用米尺測量；葉面積用YMJ-B型便攜式葉面積測定儀(浙江托普儀器有限公司)測定；葉綠素含量用TYS-A型活體葉綠素測定儀(浙江托普儀器有限公司)測定；光合指標用TPS-2便攜式光合儀(美國PPSYSTEM)測定。

1.2.2 細胞壁獲取及相關成分含量測定

參照Abdelilah等[6]的方法獲取細胞壁。木質素含量測定參照Finger-Teixeira等[7]的方法。果膠含量測定參照Blumenkrantz等[8]的方法。

1.2.3 細胞壁結合酶提取及活性測定

細胞壁結合酶提取、PG和Cx活性測定參照曹建康等[9]的方法。CAPX活性測定參照Pedreo等[10]的方法。NADH-POD和GPOD活性測定參照Fecht-Christoffers等[11]的方法。

1.2.4 H2O2組織化學檢測和含量測定

H2O2的組織化學檢測參照Romero-Puertas等[12]的DAB染色法。H2O2含量測定參照Jiang等[13]的方法。

1.2.5 質外體汁液獲取及抗氧化酶活性測定與電泳

質外體汁液獲取參照Vanacker等[14]的方法。SOD活性測定參照Giannopolitis等[15]的方法，活性電泳采用PAGE方法，活性顯色參照Beauchamp等[16]的方法。APX活性測定參照Nakano等[17]的方法，APX活性電泳采用PAGE方法，參照Klotz等[18]的方法顯色。CAT活性測定參照Rao等[19]的方法，CAT活性電泳采用PAGE方法，參照Klotz等[18]的方法顯色。POD活性測定和電泳參照Csiszr等[20]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0和Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)計算，采用Duncan’s法進行單因素差異顯著性分析，顯著性水平設置為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 Cd對龍葵生長特性的影響

由表1可見，與對照相比，50 μmol·L-1Cd處理120 d后，顯著抑制了龍葵地上和地下部的伸長生長、降低了根的干鮮質量(P<0.05)，但莖的次級分枝增多，葉面積與對照相比無顯著差異(P>0.05)，其長勢仍然旺盛(圖1)。

2.2 Cd對龍葵光合特性的影響

由圖2可知，與對照相比，50 μmol·L-1Cd處理120 d后，其葉綠素含量、凈光合速率和胞間CO2濃度沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05)，說明50 μmol·L-1Cd處理并未對龍葵的光合特性產(chǎn)生顯著的影響。

2.3 龍葵葉片和質外體汁液中H2O2的積累

根據(jù)活性氧H2O2與DAB反應產(chǎn)生棕紅色聚合物的原理，將0和50 μmol·L-1Cd處理120 d的葉片浸泡處理后的結果如圖3-A和B所示。相比之下，50 μmol·L-1Cd處理的葉片上出現(xiàn)較多棕紅色斑塊(點)，說明50 μmol·L-1Cd處理在葉片中積累了H2O2。其中，有一部分積累在葉片質外體汁液中。圖3-C表明，50 μmol·L-1Cd處理使葉片質外體汁液中的H2O2達到對照的1.10倍，差異顯著(P<0.05)。

表1 Cd對龍葵生長特性的影響

Table 1 Effect of Cd treatment on growth ofSolanumnigrumL.

Cd濃度Cd concentration(μmol·L-1)根長Rootlength/mm莖長Stemlength/mm葉面積Leaf area/mm2根鮮質量Root freshweight/g莖鮮質量Stem freshweight/g葉鮮質量Leaf freshweight/g根干質量Root dryweight/g莖干質量Stem dryweight/g葉干質量Leaf dryweight/g莖主次級分枝數(shù)Branchnumber of sterm021.55±1.376.62±2.2542.34±1.695.84±0.1239.10±2.1238.30±1.580.56±0.036.55±0.352.75±0.153.10±0.35018.02±0.98?66.27±1.86?41.46±1.504.72±0.55?38.23±1.7638.75±2.000.49±0.04?5.25±0.162.68±0.107.40±0.5

表中數(shù)值為3次重復的平均值±SD。*表示在0和50 μmol·L-1Cd處理間0.05水平上存在顯著差異。下同。

The values in the table were the average values of 3 repetitions ± SD. * indicated significant difference at 0.05 level between 0 and 50 μmol·L-1Cd treatment. The same as below.

圖1 龍葵生長對Cd的響應Fig.1 Response of Solanum nigrum L. to Cd treatment

2.4 龍葵葉細胞壁結合酶活性和結構成分對Cd的響應

由表2可見，與對照相比，50 μmol·L-1Cd處理120 d使葉細胞壁結合的NADH-POD、GPOD和CAPX活性分別提高到對照的2.59、1.64和1.65倍，差異顯著(P<0.05)，PG活性降低到對照的64.2%，差異顯著(P<0.05)，Cx無顯著變化(P>0.05)。

圖2 Cd對龍葵光合特性的影響Fig.2 Effect of Cd treatment on photosynthetic characteristics of Solanum nigrum L.

圖3 龍葵葉片和質外體汁液中H2O2的積累Fig.3 H2O2 accumulations in leaf and in its apoplast sap

由圖4可知，50 μmol·L-1Cd處理的細胞壁中果膠含量是對照的1.94倍，差異顯著(P<0.05)，但木質素含量增加不顯著(P>0.05)。

表2 Cd對龍葵葉細胞壁結合酶活性的影響

Table 2 Effect of Cd treatment on the activity of cell wall binding enzymes in leaf ofSolanumnigrumL.

Cd濃度Cd concentration/(μmol·L-1)NADH-過氧化物酶NADH-peroxidase/(μmol·g-1)愈創(chuàng)木酚過氧化物酶Guaiacol-type peroxidase/(μmol·g-1)松柏醇過氧化物酶Coniferyl alcoholperoxidase/(mmol·g-1)多聚半乳糖醛酸酶Polygalacturonase/(μg·h·g-1)纖維素酶Cellulase/(mg·h·g-1)018.23±0.43 47.62±0.33 1.10±0.09 16.95±0.90 0.45±0.01 5047.29±4.36?78.24±4.03?1.81±0.09?10.92±0.49?0.47±0.01

圖4 Cd對龍葵葉細胞壁結構成分的影響Fig.4 Effect of Cd treatment on the activity of cell wall components in leaf of Solanum nigrum L.

2.5 龍葵葉片質外體汁液中抗氧化酶活性對Cd的響應

與對照相比，50 μmol·L-1Cd處理沒有改變葉片質外體汁液中GPOD的同工酶譜和活性(圖5-A)，也沒有改變CAT同工酶譜帶的數(shù)量，但譜帶增寬(圖5-C)，活性提高至對照的6.5倍，差異顯著(P<0.05)。與此不同，50 μmol·L-1Cd處理既沒有明顯改變葉片質外體汁液中SOD同工酶譜，也沒有改變其活性，與對照相比無顯著差異(P<0.05)。然而，50 μmol·L-1Cd處理明顯增加了葉片質外體汁液中APX同工酶譜數(shù)量，有可見的3條譜帶出現(xiàn)，其活性是對照的3.5倍(圖5-D)，差異顯著(P<0.05)。

1和2為0μmol·L-1 Cd(對照)下的同工酶譜；3和4為50 μmol·L-1 Cd處理下的同工酶譜。1 and 2 were isozyme profiles of 0 μmol·L-1 Cd (Control); 3 and 4 were isozyme profiles of 50 μmol·L-1 Cd treatment.圖5 Cd對龍葵葉片質外體汁液GPOD(A)、SOD(B)、CAT(C)和APX(D)活性及其同工酶的影響Fig.5 Effect of Cd treatment on GPOD(A)， SOD(B)， CAT(C)and APX(D) activity and its isozyme profile in leaf apoplast sap of Solanum nigrum L.

3 討論

3.1 龍葵生長及光合特性對Cd污染的響應

研究已經(jīng)證明，對于Cd敏感植物來說，短時間Cd污染或Cd處理明顯干擾其正常生長發(fā)育，表現(xiàn)為生長受抑[21-22]、葉綠素含量降低[23]等。本研究證實，較長時間的50 μmol·L-1Cd處理顯著抑制了龍葵地上和地下部的伸長生長，降低了根的鮮、干質量(P<0.05)，但莖和葉的鮮、干質量沒有受到顯著影響(P>0.05)(表1)，這與Cd處理后莖的分枝增多有關。與此同時，龍葵植株長勢依然旺盛(圖1)，推測這與Cd處理后其葉面積、葉綠素含量、凈光合速率和胞間CO2濃度無顯著變化有關(P>0.05)。

3.2 龍葵葉片細胞壁成分和相關酶活性對Cd的響應

細胞壁是植物組織質外體的一部分，是保護細胞原生質體不受外界侵害的第一道防線。其主要組成物質有纖維素、半纖維素、木質素和果膠等。研究發(fā)現(xiàn)，植物可通過改變細胞壁結構物質的含量來抵抗重金屬脅迫，并增強對重金屬的吸附固定能力[24]，施用氮氧化物可增加水稻根細胞壁中果膠的含量，進而增加根細胞壁對Cd的吸附固定[25]。張虹等[4]研究證明，葉細胞壁上的果膠吸附Cd的作用較明顯，果膠為Cd的結合提供了羥基官能團。本研究中，50 μmol·L-1Cd處理120 d顯著提高了龍葵葉細胞壁果膠含量(圖4)，推測由此增加了Cd結合的羥基官能團使Cd固定在細胞壁上，防止了龍葵細胞原生質體免受傷害。與此同時，50 μmol·L-1Cd處理120 d顯著降低了PG的活性(表1)，此酶活性降低說明果膠被水解的幾率降低，在一定程度上保證了有更多的果膠和Cd結合。

木質素是構成植物細胞壁的成分之一，是由3種醇單體(對香豆醇、松柏醇、芥子醇)形成的復雜酚類聚合物，它填充于細胞壁纖維素骨架中增強細胞壁的硬度，調控著植物的生長發(fā)育。赤小豆中木質素是由細胞壁結合的愈創(chuàng)木酚型的POD催化產(chǎn)生的[26]。POD廣泛分布在植物組織中，因其作用底物不同而發(fā)揮著不同的功能。在質外體中，POD以NADH作為底物時催化NADH氧化產(chǎn)生H2O2，以愈創(chuàng)木酚或松柏醇為底物時利用H2O2催化細胞壁酚類物質的氧化和木質素合成[11]。本研究中，50 μmol·L-1Cd處理120 d，龍葵葉細胞壁中木質素的含量無顯著變化，但細胞壁結合的NADH-POD、GPOD、CAPX活性顯著提高(表2)。此處，CAPX活性升高并沒有導致木質素含量升高，這可能與H2O2被活性同樣升高的GPOD清除有關，或與Cd處理后底物愈創(chuàng)木酚含量高于松柏醇類物質有關，或與H2O2進入質外體汁液有關(圖3-C)，CAPX活性升高是否與CAPX基因表達有關尚需進一步研究。有人認為，挪威云杉針葉木質素聚合物的形成與質外體GPOD活性增加有關[27]。本研究中，質外體GPOD活性在50 μmol·L-1Cd處理120 d后無顯著變化(圖5-A)，這與木質素含量無顯著變化相一致。Cx水解纖維素成為葡萄糖，對植物細胞壁有溶解破壞作用。本研究中，50 μmol·L-1Cd處理120 d沒有顯著影響Cx的活性，這也是龍葵生長仍然保持良好狀態(tài)的原因之一。

3.3 基于葉片質外體相關成分和酶活性變化的龍葵耐Cd機理

由以上結果可得，Cd處理作用于龍葵葉片質外體的細胞壁和質外體汁液，使二者出現(xiàn)了不同響應。由此推測龍葵耐Cd機理如下：(1)細胞壁結合酶PG的活性降低有利于維持壁上有較多的果膠；(2)細胞壁果膠含量升高有助于更多的Cd結合于細胞壁，減輕葉細胞原生質體受Cd毒害的程度；(3)細胞壁結合酶NADH-POD活性升高，產(chǎn)生較多的H2O2，但由于GPOD活性的升高將一部分H2O2清除，另有部分H2O2則進入質外體汁液，此時即使細胞壁結合酶CAPX活性升高也因H2O2含量降低到不足以合成較多的木質素，故細胞生長不會受到顯著限制；(4)進入質外體汁液的H2O2，因Cd處理導致的質外體中清除H2O2的CAT和APX活性升高而清除掉，由此保證了進入質外體的H2O2返回細胞壁，再進入葉細胞原生質體，從而降低了Cd的毒害；(5)細胞壁結合酶Cx的活性無顯著改變，也有利于維持細胞壁的良好結構。

綜上，50 μmol·L-1Cd處理120 d龍葵植株生長旺盛，其耐Cd機理在于葉片質外體組分細胞壁上有較高的果膠含量以固持Cd，細胞壁和質外體汁液中分別有較高活性的GPOD和CAT、APX以清除由Cd誘導產(chǎn)生的H2O2而使植株免遭活性氧傷害。