CNP、12/15-LOX基因多態(tài)性與早發(fā)冠心病關(guān)系的研究

路艷 郭紀(jì)文 徐曉輝 衛(wèi)艷寧 朱彤 王琴麗

(西電集團醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710000)

冠心病(coronary artery disease，CAD)是全球主要致死、致殘疾病之一，嚴(yán)重威脅人類健康和患者生存質(zhì)量[1]。隨著CAD發(fā)病年齡的日漸年輕化，人們又提出早發(fā)冠心病(premature coronary artery disease，PCAD)的概念，即CAD發(fā)生時男性≤55 歲，女性≤65 歲。遺傳學(xué)規(guī)律表明，疾病發(fā)生越早，與遺傳學(xué)關(guān)系越密切。CNP通過與細(xì)胞表面NPR-B及 NPR-C結(jié)合，分別激活GC-cGMP-PKGI通路、Gi-AC-cAMP-PLC通路以及MAPK級聯(lián)通路等發(fā)揮多種心血管生物調(diào)節(jié)功能[2-4]。CNP具有調(diào)節(jié)血管張力，抑制血小板、白細(xì)胞相互作用及活化，調(diào)節(jié)內(nèi)皮、血管平滑肌增殖，抑制心肌細(xì)胞肥大等功能，進(jìn)而參與動脈粥樣硬化、主動脈瓣鈣化、心室重構(gòu)、支架內(nèi)再狹窄以及缺血—再灌注損傷等多種心血管病理生理過程的調(diào)節(jié)[5-8]。12/15-LOX能夠參與到機體炎性反應(yīng)的過程中，而冠心病患者冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生，同樣與血管內(nèi)皮損傷及炎性反應(yīng)有關(guān)[9-13]。本研究采用MALDI-TOF法，通過對CNP基因位點rs5262、12/15-LOX基因位點rs916055的單核酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的研究，進(jìn)一步探討了CNP、12/15-LOX 基因多態(tài)性與PCAD遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2017年4月至2018年4月我院心內(nèi)科住院PCAD患者58例(男≤55歲，女≤65歲)作為實驗組，患者均符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動脈造影證實至少1支主要冠狀動脈狹窄≥50%。入選62例非冠心病者作為對照組，經(jīng)冠狀動脈造影排除CAD。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌病、先天性心臟病、嚴(yán)重肝臟和腎臟疾病。兩組患者年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 iPLEX試劑盒；質(zhì)譜檢測儀器；SpectroCHIP芯片；引物合成；DNA提取試劑盒等。

1.3研究方法 采晨空腹靜脈血4～5 mL，行相關(guān)實驗室指標(biāo)檢測，余血EDTA抗凝，-80℃保存，用于后續(xù)SNP位點基因型鑒定。按DNA提取試劑盒操作步驟并檢測OD值(A260/A280)，A260/A280>1.8，則DNA純度合格。

1.4PCR-MALDI-TOF法檢測rs5262、rs916055位點的SNPs 使用MassARRAY Assay Design軟件和Sequenom公司Genotyping Tools對rs5262和rs2728121兩位點PCR擴增引物及單堿基延伸引物進(jìn)行設(shè)計，引物詳細(xì)信息見表1。PCR擴增：94 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行45個循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min，4 ℃。PCR產(chǎn)物純化：采用兩種方式對溫度與時間進(jìn)行了控制，當(dāng)溫度為37 ℃時，應(yīng)將純化的時間控制在20 min。隨著溫度的上升，純化時間可逐漸縮短。當(dāng)溫度達(dá)到85 ℃時，僅純化5 min便可達(dá)到滿意的效果。單堿基延伸反應(yīng)：首先將溫度設(shè)置為了94 ℃，該溫度下，反應(yīng)30 s便可達(dá)到實驗所需要的效果。隨后，本研究在溫度不變的情況下，將反應(yīng)時設(shè)置為了5 s，進(jìn)一步對反應(yīng)效果進(jìn)行了觀察。質(zhì)譜檢測：純化后置入在384孔SpectroCHIP芯片上，進(jìn)行上機測定，使用MALDI-TOF技術(shù)對SpectroCHIP芯片進(jìn)行分型檢測，結(jié)果使用Sequenom TYPER 4.0軟件分析。

表1 SNP分型引物序列

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料比較 實驗組男/女、年齡、膽固醇、低密度脂蛋白、體重指數(shù)、糖尿病與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組吸煙史、高血壓史、CAD家族史與對照組對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 一般臨床資料的比較

2.2rs5262、rs916055位點基因型與等位基因在兩組的分布 rs5262位點、rs916055位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。實驗組與對照組rs5262位點存在A/A、A/G、G/G的三種基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。我們推測，rs5262等位基因與PCAD發(fā)病無相關(guān)性。兩組rs916055位點基因型差異顯著(P<0.001)，實驗組A等位基因攜帶率高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，實驗組組AA+AG基因型頻率較高，我們認(rèn)為，rs916055 中A等位基因，與疾病的發(fā)生存在一定的關(guān)系，見表3。為了排除吸煙史，高血壓病史和CAD家族史對多態(tài)位點與PCAD相關(guān)性之間相關(guān)性的影響，我們在調(diào)整了上述危險因素后，進(jìn)一步進(jìn)行了二項Logistic回歸分析，見表4。rs916055 位點A等位基因的OR(95%CI)為3.622(2.140～6.128，P<0.001)。

表3 rs5262、rs916055的基因型與等位基因頻率在實驗組和對照組的分布

2.3rs5262、rs916055位點PCR擴增產(chǎn)物質(zhì)譜分析結(jié)果 見圖1～2。

表4 rs5262 G、rs916055 A等位基因與實驗組的Logistic回歸分析

圖1 rs5262 圖2 rs916055

3 討 論

CAD是一種威脅當(dāng)今人類健康的常見疾病，目前被認(rèn)為是由包括遺傳因素在內(nèi)的復(fù)雜多因素疾病。隨著近年來CAD發(fā)病年青化傾向，提出了PCAD的概念?；蚨鄳B(tài)性是指在某個基因座上≥2個不同等位基因，基因的多態(tài)性逐漸成為了近年來冠心病危險因素研究的新領(lǐng)域。CNP是利鈉肽家族成員，由VEC合成，以自分泌和旁分泌的形式發(fā)揮調(diào)節(jié)局部血管張力，抑制血小板、白細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)VEC、VSMC增殖，抑制心肌細(xì)胞肥大以及拮抗ET-1作用等多種生物學(xué)活性。推測其可能在動脈粥樣硬化、心室重構(gòu)、支架內(nèi)再狹窄以及缺血-再灌注損傷等多種心血管病理生理過程發(fā)揮重要作用[14-16]。12/15-LOX屬于脂氧合酶家族，有充分證據(jù)表明12/15-LOX參與動脈粥樣硬化的發(fā)展。12/15-LOX通過炎癥反應(yīng)參與動脈粥樣硬化的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者[9-13]已探索了12/15-LOX基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化斑塊的關(guān)系，其結(jié)論并不完全一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組rs5262位點存在A/A、A/G、G/G差異顯著(P<0.001)，表明三者與冠心病的發(fā)生之間，存在顯著的相關(guān)性，臨床應(yīng)對該問題加以重視。從以上結(jié)果我們同樣可以推測，rs5262等位基因與PCAD發(fā)病無相關(guān)性。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，兩組A基因型頻率相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，實驗組A基因型頻率較高為82.76%。通過對上述數(shù)據(jù)的觀察可以發(fā)現(xiàn)，rs916055 中A等位基因的存在，與PCAD的發(fā)生有關(guān)。臨床可通過檢測該基因，實現(xiàn)對冠心病發(fā)病風(fēng)險的評估，并以之為基礎(chǔ)，對早發(fā)冠心病發(fā)病的地域性差異進(jìn)行分析，為臨床對疾病的控制提供參考。

眾所周知，吸煙、高血壓和CAD遺傳史是PCAD發(fā)病的獨立危險因素。為了排除混雜因素對結(jié)果的影響，使用Logistic回歸分析來調(diào)整吸煙、高血壓和CAD遺傳史，調(diào)整后rs916055等位基因A仍是PCAD的危險因素(P<0.001)，即A等位基因PCAD的風(fēng)險相對較高。該研究證實rs916055具有遺傳預(yù)測作為PCAD風(fēng)險因素的潛力。

綜上所述，12/15-LOX基因位點rs916055的SNPs與陜西漢族人群PCAD的遺傳易感性有關(guān)，為預(yù)防和篩查PCAD提供了理論依據(jù)。