沉默miRNA-16對肺結(jié)核模型小鼠免疫功能的調(diào)控作用及其機制研究

王 琴，付 宇，王 平

(湖北省十堰市人民醫(yī)院 兒科，湖北 十堰 442000)

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌所引發(fā)的傳染性疾病，有研究表明，結(jié)核病為一種傳染性死亡的病因，肺結(jié)核的死亡率僅低于免疫缺陷病毒性疾病的死亡率，嚴重威脅著全球人類的身體健康，我國肺結(jié)核的發(fā)病率處于世界第二位，且隨著醫(yī)療費用的不斷增長，研究肺結(jié)核的發(fā)病機制迫在眉睫[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)[2]miRNA與艾滋病、乙型病毒性肝炎、非典型肺炎、肺結(jié)核等多種感染性疾病的發(fā)生有關(guān)。Abdalla等[3]在其研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌可對miRNA產(chǎn)生改變作用，一方面可對巨噬細胞的死亡通路進行調(diào)控，另一方面miRNA可促進結(jié)核分枝桿菌在人體細胞內(nèi)生存，對炎癥介質(zhì)的發(fā)生產(chǎn)生阻斷作用。Wagh等[4]研究結(jié)果顯示miR-16在肺結(jié)核患者中的水平顯著高于健康人，且Miotto等[5]在其研究證實miR-16水平的增加是在肺結(jié)核導致的溶血過程中所體現(xiàn)的。但目前對于miR-16作用于肺結(jié)核的機制臨床上尚未有研究，因此在本文研究中為研究miR-16在肺結(jié)核中的作用機制，建立肺結(jié)核模型小鼠，沉默miR-16的表達，以明確miR-16的作用機制，為臨床上肺結(jié)核的研究提供新方向。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級CD2F1雌性小鼠40只，體重18～29 g，8周齡，均購于中國科學院過程工程研究所[SCXK(京)2019-0004]，無菌手術(shù)在中國科學院過程工程研究所動物實驗中心屏障動物實驗設施進行[SYXK(京)2019-0011]。所有小鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間為一周。本文研究實驗獲得我院倫理委員會批準(IACUC20190603)，并符合實驗動物使用的3R原則。

1.1.2 菌株

標準人型結(jié)核菌株H37Rv(購自加拿大GE Healthcare)。

1.2 主要試劑

PE標記的小鼠抗人CD11b/Mac-1抗體、APC標記的小鼠抗人CD33抗體、FITC標記的小鼠抗人HLA-DR抗體、PE標記的小鼠抗人CD3抗體、FITC標記的小鼠抗人PD-1抗體(均購于美國艾美捷SouthernBiotec，貨號∶9546-09、9590-11、9568-16、9558-12、9550-08)；PBS緩沖液、Ficoll液(上海恒斐生物科技有限公司，貨號∶P1010、CS0024)；DHank’s液(北京華邁科生物技術(shù)有限責任公司，貨號∶HMK0011)；小鼠抗大鼠IL-2抗體、小鼠抗大鼠IFN-γ抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號∶FNab09820、BA3383-2)；小鼠抗大鼠IL-15抗體(艾美捷科技有限公司，貨號∶5172-100)。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢病毒載體構(gòu)建

miR-16表達抑制的慢病毒載體構(gòu)建及測定大鼠miR-16的序列查找和設計由廣州易錦公司完成。重組的LV-miR-16和LV-sponge(抑制載體)慢病毒表達載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測序并測定慢病毒滴度，重組慢病毒，置于-80℃冰箱備用。

1.3.2 分組及建模

選取40只CD2F1雌性小鼠中10只作為正常組，其余小鼠均參照王青樂等[6]研究實驗中肺結(jié)核小鼠模型的建立方法建立肺結(jié)核小鼠模型，使用標準人型結(jié)核菌株H37Rv在ABSL-3級實驗室采用滴鼻法對進行感染處理，菌液濃度為1×107CFU/mL，所有小鼠每只均滴鼻20μL，建立肺結(jié)核小鼠模型。在建模成功后，將肺結(jié)核小鼠隨機分為模型組、過表達組、沉默組各10只，沉默組小鼠肺部注射含10 μL miR-16抑制載體的慢病毒懸液，過表達組小鼠肺部注射含10μL miR-16表達載體的慢病毒懸液，正常組、模型組小鼠不做任何處理。

1.3.3 切片及染色

隨機各選取四組小鼠中任意1只，行全麻處理后，處死，在無菌、低溫條件下取小鼠肺組織，將小鼠肺組織在4%多聚甲醛中浸泡、固定，在溫度為4℃的環(huán)境下進行保存。之后行HE染色處理，觀察病理組織變化。

1.3.4 T淋巴細胞亞群、胸腺指數(shù)檢測

取小鼠尾靜脈血2 mL，使用肝素鈉行抗凝處理，使用流式細胞儀檢測小鼠T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。胸腺指數(shù)測定:將小鼠的胸腺完全剝離，立即使用電子天平測定重量，計算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.5 肺炎癥指標檢測

采用ELISA法檢測炎癥指標，具體方法如下:將肺組織研磨成漿，取適量包被液(pH＝9.5，0.05 mol/L)稀釋，分別將0.1 mL抗IL-6、IL-10及TNFα置于聚苯乙烯反應板孔內(nèi)，并置于4℃放置過夜，應用洗滌劑洗滌，向各孔分別加入Tris-HCl緩沖液(pH＝7.4，0.02 mol/L)稀釋待測標本至0.1 mL，同法制作陰性與陽性對照，在43℃水浴恒溫保持1.0 h，移除液體并甩干。向各孔分別加入0.1 mL IL-6、IL-10及TNF-α的酶標抗體，繼續(xù)在43℃水浴恒溫保持1.0 h，移除液體并甩干。向各孔中加入0.1 mL底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)+4.86 mL枸櫞酸(0.05 mol/L)+4 mg鄰苯二胺)，遮光放置30 min，再在各孔中加入終止液2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應。在酶標儀上讀取波長為405 nm處的吸收值，參照標準曲線計算肺組織的IL-6、IL-10及TNF-α水平。

1.3.6 TLRs信號通路因子檢測

采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進行檢測，25μL的反應體系:2.5μL PCR緩沖液、1.5μL MgCl2、0.5μL上下游引物，加水至25μL。反應條件:94℃60 s、55℃60 s、72℃60 s，35個循環(huán)，72℃延長5 min，采用2-△△Ct法計算待測的TLR2、TLR4、NFκB相對表達，每個樣品重復3次取均值，β-actin為內(nèi)參。TLR2:上游引物:5’-CTGAGCCTCGTCCATG CCACTC-3’；下游引物:5’-GGCCAGCAAATTACCT GTGTG-3’。TLR4:上游引物:5’-TGGATACGTTTC CTTATAAGG-3’；下游引物:5’-GAAATGGAGGCAC CCCTTC-3’。NF-κB:上游引物:5’-CAAGATCTTG CCGAGTAAACC-3’；下游引物:5’-TCGGAACACA ATGGCCACTT-3’。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計分析本文的數(shù)據(jù)，其中計量資料，如IL-6、IL-10及TNF-α，采用“平均數(shù)±標準差”(±s)方式進行描述，多組間的計量資料比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用SNK檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般形態(tài)變化

正常組小鼠皮毛光滑有亮澤，精神狀態(tài)較好，飲食正常，無死亡。模型組小鼠皮毛無光澤、稀疏，反應遲鈍，精神不佳，飲食減少，大便稀溏，其中2只小鼠因胸腔淤血死亡，另外8只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié)。過表達組小鼠皮毛較為稀疏，無光澤，精神萎靡，飲食明顯減少，其中3只小鼠因胸腔淤血死亡，另外7只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié)，并布滿整個肺部。沉默組小鼠，毛色恢復光澤，喜好活動，精神狀態(tài)較好，飲食正常，偶爾出現(xiàn)大便干結(jié)，其中2只小鼠因胸腔淤血死亡，1只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié).

2.2 四組小鼠肺組織病理變化觀察

如圖1所示，正常組小鼠肺組織支氣管、肺泡清晰可見，無增生、滲出、壞死的出現(xiàn)；模型組小鼠肺組織形態(tài)發(fā)生病理改變，出現(xiàn)滲出、壞死現(xiàn)象；過表達組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理變化，有較為嚴重的滲出、壞死的發(fā)生；沉默組小鼠存在肺組織病理改變，可見有少量的增生和滲出現(xiàn)象，無壞死的發(fā)生。

2.3 四組小鼠T淋巴細胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較

如表1所示，模型組、過表達組、沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)低于正常組，CD8+高于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；過表達組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)低于模型組，CD8+高于模型組，沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)高于模型組，CD8+低于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)高于過表達組，CD8+低于過表達組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

2.4 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達水平比較

如表2所示，模型組、過表達組、沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平高于正常組，IL-10水平低于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；過表達組小鼠IL-6、TNF-α水平高于模型組，IL-10水平低于模型組，沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平低于模型組，IL-10水平高于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平低于過表達組，IL-10水平高于過表達組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

注:A:正常組；B:模型組；C:過表達組；D:沉默組。圖1 四組小鼠肺組織病理變化HE染色圖Note.A，Control group.B，Model group.C，Overexpression group.D，Silence group.Figure 1 HE staining of lung histopathological changes in four groups of mice

表1 四組小鼠T淋巴細胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較(±s)Table 1 Changes of T lymphocyte subsets and thymus index in four groups of mice

表1 四組小鼠T淋巴細胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較(±s)Table 1 Changes of T lymphocyte subsets and thymus index in four groups of mice

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與過表達組相比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+(%)胸腺指數(shù)(mg/g)Thymus index正常組Control group 10 68.59±6.48 39.25±2.46 25.98±2.49 1.79±0.62 3.89±1.12模型組Model group 8 52.13±1.68* 23.25±1.01* 42.36±6.28* 0.61±0.26* 2.30±0.15*過表達組Overexpression group 7 43.58±0.67*＃ 19.58±0.27*＃46.59±9.58*＃ 0.54±0.15*＃ 2.04±0.04*＃沉默組Silent group 8 60.39±2.33*＃△31.45±3.58*?！?9.67±1.72*?！?.15±0.23*?！?2.98±0.09*＃△F 5.086 8.217 5.336 4.137 3.417 P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

表2 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達水平比較(±s)Table 2 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissues of four groups of mice

表2 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達水平比較(±s)Table 2 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissues of four groups of mice

注:與正常組比，*P＜0.05；與模型組比，＃P＜0.05；與過表達組比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases IL-6(pg/mL) IL-10(pg/mL) TNF-α(ng/L)正常對照組Normal control group 10 30.23±1.12 76.59±9.56 6.45±0.57模型組Model group 8 58.69±3.45* 40.12±5.69* 23.59±2.16*過表達組Overexpression group 7 66.89±6.17*＃ 32.59±6.48*＃ 26.59±3.96*＃沉默組Silent group 8 42.58±2.96*?！?63.89±2.47*?！?13.24±1.12*＃△F 18.331 5.461 25.104 P 0.001 0.001 0.001

2.5 沉默miR-16對肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號通路因子的影響

如表3所示，模型組、過表達組、沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平高于正常組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；過表達組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平高于模型組，沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平低于模型組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平低于過表達組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所導致的疾病，主要通過呼吸道感染，可引發(fā)全身多器官病變，其中以肺結(jié)核最為常見，屬于一種臨床上較為常見的慢性傳染病，具有高患病率、高感染率、高耐藥率、高死亡率等特點。且近年來隨著HIV感染率的增加、多重耐藥因素的影響以及空氣污染的加重，導致肺結(jié)核的發(fā)病率逐漸升高[7]。目前隨著對肺結(jié)核的深入研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核屬于一種免疫相關(guān)性疾病，當機體免疫功能下降后導致感染加重，而免疫治療可通過改善患者機體免疫功能抵抗感染，效果顯著[8]。因此臨床上將肺結(jié)核的研究方向轉(zhuǎn)移至結(jié)合的免疫反應中。結(jié)核免疫的重要組成部分為細胞，通過調(diào)節(jié)免疫細胞的生長、分化，一方面殺滅結(jié)合分枝桿菌，另一方面啟動負反饋調(diào)節(jié)限制過度的炎癥反應給機體所帶來的損傷[9]。而有研究發(fā)現(xiàn)[10]，miR-16參與塵肺合并肺結(jié)核患者的免疫應答反應，因而在血清呈高表達。

自1993年miRNA倍發(fā)現(xiàn)以來，大量新的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性成熟的miRNA已有2500條以上。miRNA在真核生物中廣泛存在，其長度一般為18個核苷酸-25個核苷酸，屬于一種高度保守、非編碼的小分子單鏈RNA[11-12]。目前有較多的研究[13-14]已發(fā)現(xiàn)miRNA通過干擾、降解、抑制其靶基因的表達而參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理和病理過程，因而在免疫應答中占據(jù)重要作用。顏保松等[15]在其研究中發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-223、miR-424在肺結(jié)核患者外周血中的表達與健康人外周血單個核細胞中的表達具有差異。楊紹俊等[16]在其研究中認為肺結(jié)核患者血清中miR-155表達升高。另外賀晨艷等[17]在其研究中發(fā)現(xiàn)miR-146、miR-147參與肺結(jié)核的發(fā)展?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn)，血清中miRNA的表達與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-16家族包括miR-15b/16-1、miR-15b/16-2，其分別位于人12q14、3號染色體上，miR-16參與多種疾病的發(fā)生[18]。

Toll樣受體其定位于細胞膜中，當其和細胞膜的受體產(chǎn)生結(jié)合作用后，胞內(nèi)下游的NF-κB會被活化，進而刺激過量的炎癥因子的分泌，導致機體炎癥損傷。有研究認為[19]，Toll樣受體屬于和天然免疫有密切關(guān)系的膜蛋白，且認為TLR2、TLR4和免疫活化有關(guān)，并參與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等。目前已經(jīng)證實，TLRs信號通路和多種免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展、預后相關(guān)。有研究表明[20]，肺結(jié)核患者細胞膜上的TLRs信號通路因子的異常表達可促進疾病的進展。TLRs屬于一種分岐桿菌感染的關(guān)鍵感受器，具有啟動、協(xié)調(diào)抗分岐桿菌先天性免疫反應過程的作用，在組織中為特異性的表達，TLRs在細胞類型、組織間的表達具有一定的差異性，在肺組織結(jié)構(gòu)中肺上皮細胞、肉芽中組織中的淋巴細胞中TLR2表達，在人外周血單核細胞中有TLR1、TLR2、TLR3表達等[21-22]。

表3 沉默miR-16對肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號通路因子的影響(±s，mg/L)Table 3 Effect of silencing microRNA-16 on TLRs signaling pathway factors in mice with pulmonary tuberculosis

表3 沉默miR-16對肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號通路因子的影響(±s，mg/L)Table 3 Effect of silencing microRNA-16 on TLRs signaling pathway factors in mice with pulmonary tuberculosis

注:與正常組比，*P＜0.05；與模型組比，＃P＜0.05；與過表達組比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases TLR2 TLR4 NF-κB正常組Control group 10 2.35±0.24 2.36±0.16 2.39±0.42模型組Model group 8 4.89±1.23* 5.46±1.35* 4.98±1.72*過表達組Overexpression group 7 5.88±2.49*＃ 7.12±2.15*＃ 6.15±2.45*＃沉默組Silent group 8 3.63±1.04*?！?3.56±0.89*＃△ 3.45±0.98*?！鱂 5.693 6.316 4.651 P 0.001 0.001 0.001

TLRs信號通路是目前臨床上認為調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應的重要通路，而時廣利等[23]在其研究中發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血清中miRNA-16表達升高，其研究推測miRNA-16可能參與肺結(jié)核的免疫應答反應。因此基于上述研究本文擬認為，miRNA-16參與肺結(jié)核的應答反應的作用機制可能為TLRs信號通路。在本文研究中，研究沉默miRNA-16對肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號通路因子進行檢測，結(jié)果顯示，沉默miRNA-16后TLRs信號通路因子TLR2、TLR4、NFκB水平顯著降低，且肺組織中炎癥因子和免疫細胞因子水平均得到顯著改善，此結(jié)果說明，沉默miRNA-16改善肺結(jié)核小鼠免疫功能可能通過作用于TLRs信號通路，改善TLRs信號通路因子的表達，進而促進浸提產(chǎn)生一系列的抗結(jié)核的保護免疫反應，最終抑制結(jié)核的發(fā)展。

綜上所述，沉默miRNA-16可能通過作用于TLRs信號通路，抑制通路因子的異常表達，調(diào)節(jié)機體免疫反應，改善機體免疫障礙而起到調(diào)控肺結(jié)核小鼠免疫功能的作用。