降脂模型研究進(jìn)展

王 成，胡乃華，余琳媛，龔莉虹，代旭陽(yáng)，李蕓霞

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與 開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137)

隨著全球人民生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)已逐漸成為嚴(yán)重危害全人類(lèi)身體健康的“第一殺手”，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，HLP及其并發(fā)癥占據(jù)了全球死亡率的50%[2]。在中醫(yī)古籍中，雖然沒(méi)有對(duì)“高脂血癥”這病癥的明確記載，但早在秦漢時(shí)期的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有“脂者”、“油脂”、“脂膜”等關(guān)于脂的相關(guān)論述，且還用“膏人”、“肥人”等詞來(lái)形容血漿脂質(zhì)過(guò)高的人[3]。古代中醫(yī)認(rèn)為，HLP發(fā)生的原因是五臟六腑的氣化、運(yùn)輸、疏泄、宣發(fā)等生理功能失調(diào)，致使體內(nèi)津液集聚，痰濕化生，流注經(jīng)脈，滲入血中[4]。在現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域，HLP又稱(chēng)為脂質(zhì)代謝紊亂，是血液中任何或所有血脂和/或脂蛋白水平異常升高，是一種最常見(jiàn)的血脂異常形式。有研究表明，HLP是導(dǎo)致脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、腦梗死等多種疾病的首要病因[5]。

相比于降脂作用快速確切的西藥，我國(guó)傳統(tǒng)中藥治療HLP有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已知的具有降血脂功效的中草藥有100多種，中醫(yī)臨床上用于治療HLP的中成藥有200余種[6]，由此可見(jiàn)，運(yùn)用我國(guó)中醫(yī)藥理論對(duì)改善和治療HLP有著廣闊的前景。但是，因降脂單味中藥、復(fù)方和中成藥等具有分類(lèi)龐雜、種類(lèi)繁多和成分復(fù)雜的特點(diǎn)，依靠單一的降脂模型和研究技術(shù)很難對(duì)發(fā)揮作用的有效化學(xué)成分及具體降血脂的機(jī)制進(jìn)行全方面、深層次的研究。HLP的預(yù)防和治療已成為亟待解決的難題之一，高脂模型對(duì)于脂代謝性疾病以及HLP繼發(fā)的心腦血管性疾病的研究具有重大意義[7]。因此，建立一個(gè)完美的、理想的高脂模型是篩選降脂中藥和研究HLP中醫(yī)發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因素之一。目前國(guó)內(nèi)外已建立了多種高脂模型，主要分為高脂細(xì)胞模型、高脂哺乳動(dòng)物模型和高脂斑馬魚(yú)模型三種。本文就針對(duì)當(dāng)今常用的三種高脂模型進(jìn)行歸納總結(jié)，為今后進(jìn)一步探索HLP的發(fā)病機(jī)制和篩選有效的降脂中藥提供一定的選擇依據(jù)。

1 高脂細(xì)胞模型

1.1 HepG2細(xì)胞模型

人源性肝癌細(xì)胞系(human hepatocellular liver carcinoma cell line，HepG2)因其具有生長(zhǎng)周期短、高分化性、分化穩(wěn)定性和長(zhǎng)生不老性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于抗氧化、降脂保肝、抗肝癌和抗脂肪變性等研究[8]。又因其保留了完整的與人類(lèi)生物代謝相關(guān)的酶，可以正常表達(dá)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平，目前也被廣泛用來(lái)評(píng)價(jià)中藥的降脂活性。

郝正亮等[9]利用1.0×10-5mol/L的磷酸三苯酯(triphenyl phosphate，TPP)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，TPP作用于HepG2細(xì)胞24 h后用脂質(zhì)分析試劑盒和油紅O脂肪染色對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，經(jīng)TPP作用后，顯著升高甘油三酯(triglyceride，TG)的含量，增加細(xì)胞中脂滴的堆積面積，成功誘導(dǎo)高脂HepG2細(xì)胞模型。還有研究表明[10]，氧化性低密度脂蛋白(oxidation low density lipoprotein，Ox-LDL)可以通過(guò)升高載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)和降低載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)的表達(dá)而快速使HepG2細(xì)胞在48 h建立成高膽固醇模型，與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)的裂解總膽固醇(total cholesterol，TC)、裂解游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)、上清TC和上清FC均有顯著性差異，表明成功建立高膽固醇HepG2細(xì)胞模型。此外，李玉平等[11]對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的高膽固醇HepG2細(xì)胞模型的最佳濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了摸索。結(jié)果表明，50 mg/mL的Ox-LDL誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞48 h是造高膽固醇模型的最佳條件。但是，由于Ox-LDL毒性較大，容易對(duì)細(xì)胞造成凋亡等不可逆轉(zhuǎn)的損傷[12]，目前人們更多的選擇游離脂肪酸中含量最多的油酸來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型。在油酸的干預(yù)下，HepG2細(xì)胞中SREBP-1c過(guò)度表達(dá)，p-AMPK蛋白受到抑制，致使細(xì)胞內(nèi)TC和TG顯著性增加[13]，成功建立HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型。

1.2 L02細(xì)胞模型

因HepG2細(xì)胞來(lái)源于人肝胚胎腫瘤細(xì)胞，與正常人肝細(xì)胞有一定的差異，將其用于建立降脂中藥篩選模型存在較大的分歧。與此同時(shí)，另一傳代株人正常肝細(xì)胞進(jìn)入人們的視野。L02細(xì)胞是一種來(lái)自于正常人胚胎肝組織且能夠貼壁生長(zhǎng)的一種細(xì)胞，能完全模擬人類(lèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程。因此，用其復(fù)制的高脂細(xì)胞模型較HepG2細(xì)胞更具可行性和說(shuō)服性。

殷錦錦等[14]探討使用游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA，棕櫚酸和油酸混合物)來(lái)建立L02細(xì)胞脂肪變性模型。方法是往1640培養(yǎng)基中添加FFA共同培養(yǎng)L02細(xì)胞24 h，后采用油紅O染色對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂滴形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，同時(shí)檢測(cè)TG、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及細(xì)胞凋亡率來(lái)鑒定模型是否成功。結(jié)果顯示，高脂模型組細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成，TG顯著性升高，MDA含量和細(xì)胞凋亡率均沒(méi)有明顯增高，成功誘導(dǎo)高脂L02細(xì)胞模型。還有學(xué)者對(duì)FFA里油酸和棕櫚酸的比例及其它最佳條件進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。Gómez-Lechón等[15]經(jīng)全面研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FFA中油酸和棕櫚酸的比例為2∶1時(shí)，最適合用來(lái)建立高脂L02細(xì)胞模型。但是，隨著對(duì)FFA的深入研究，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)FFA是一種毒性特別強(qiáng)的二性分子，容易引起生物膜的損傷[16]，后來(lái)有學(xué)者建議用毒性更小的脂肪乳劑來(lái)建立高脂L02細(xì)胞模型。此外，袁勇等[17]還探索出當(dāng)造模液中脂肪乳劑為1.0 mL/L，造模時(shí)間為48 h時(shí)，是建立L02細(xì)胞非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型的最佳條件，適用于更深入和更全面的探索HLP和NAFLD的發(fā)病機(jī)制，篩選出防治HLP和NAFLD的有效中藥。

1.3 3T3-L1細(xì)胞模型

3T3-L1前脂肪細(xì)胞是G.J.Todaro從17～19 d Swiss系小鼠胚胎里3T3細(xì)胞中分離得到。用該細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)代謝方面的研究時(shí)，需要利用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑對(duì)其進(jìn)行刺激，使其定向分化成充滿(mǎn)脂滴的脂肪細(xì)胞才能進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)探索。誘導(dǎo)分化前3T3-L1前脂肪細(xì)胞間質(zhì)稀少，體積小，呈梭形，包漿中不含有TG的油滴[18]。誘導(dǎo)分化后則變成成熟的脂肪細(xì)胞，貼壁完好，楞角分明，大量的TG脂滴積聚于細(xì)胞核的周?chē)?T3-L1脂肪細(xì)胞是目前國(guó)際上公認(rèn)的可用于研究HLP、肥胖以及篩選降脂中藥和抗肥胖藥物的細(xì)胞模型[19]。

肥胖是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，它被認(rèn)為是HLP、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因?yàn)榉逝值却x綜合征的藥物治療提供了豐富的潛在靶點(diǎn)，Roh等[20]通過(guò)在DMEM培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑(10μg/mL胰島素，2.5μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，成功篩選出具有抗肥胖活性的植物提取物。此外，Lee等[21]在含有高葡萄糖、10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素等的DMEM培養(yǎng)基中，加雞尾酒培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞48 h，也使其成功誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。

此外，還有一些細(xì)胞也可以用來(lái)建立高脂細(xì)胞模型。如1954年從非惡性的人體組織中建立的具有無(wú)限傳代特點(diǎn)的人肝Changliver細(xì)胞、小鼠巨噬RAW264.7細(xì)胞株、來(lái)自大鼠肝的肝BRL細(xì)胞、人單核/巨噬細(xì)胞株THP-1、奶牛肝細(xì)胞和草魚(yú)肝細(xì)胞等。

常用高脂細(xì)胞建模方法的比較見(jiàn)表1。

2 高脂哺乳動(dòng)物模型

2.1 大鼠

因具有成本低、易于飼養(yǎng)、抗病力強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單和模型穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，大鼠已成為目前國(guó)內(nèi)外研究人體脂質(zhì)代謝使用率最高的一種動(dòng)物。此外，大鼠所含血液豐富，一次采血即可對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，可以較好的對(duì)脂質(zhì)的吸收、合成和分解等代謝過(guò)程進(jìn)行深入研究。

目前，在誘導(dǎo)大鼠形成高脂模型來(lái)進(jìn)行血脂代謝紊亂的實(shí)驗(yàn)中，喂養(yǎng)高脂飼料或高脂高膽固醇飼料是普遍選取的方法。Moselhy等[22]在普通飼料中添加了2%的膽固醇和0.4%的膽酸鈉制作成高脂高膽固醇飼料，用于評(píng)價(jià)麥角甾醇聯(lián)合煙酸對(duì)高脂飲食(high fat diet，HFD)大鼠的潛在降脂和降膽固醇作用。結(jié)果顯示，HFD組大鼠TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDLc)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-c)以及致動(dòng)脈粥樣因子水平均明顯高于正常組，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-c)水平低于正常組。麥角甾醇或煙酸的灌胃組，TC、TG、LDL-c均比模型組低。研究表明煙酸和麥角甾醇可以預(yù)防高膽固醇血癥和冠心病。然而，高TC的食物對(duì)大鼠并沒(méi)有吸引力，甚至還易出現(xiàn)“厭食”的情況，以致于不能精確掌握每日進(jìn)食量，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，有的學(xué)者建議用灌胃高脂乳劑法替代高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)法，這樣既可以避免進(jìn)食的不一致性，還可以根據(jù)實(shí)際需求增減高脂成分的含量，縮短造模時(shí)間。此外，還有學(xué)者將與脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性物質(zhì)作為復(fù)制高脂模型的材料。如灌胃鉛可以顯著性抑制細(xì)胞色素P450的活性，進(jìn)而影響甾醇獨(dú)立基團(tuán)調(diào)控肝酶對(duì)脂質(zhì)的代謝[23]。Liu等[24]通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行為期75 d的醋酸鉛水溶液灌胃，成功研究了葛根素可以通過(guò)降低細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧簇，更新抗氧化酶活性，闡明葛根素對(duì)鉛誘導(dǎo)的高脂血癥和肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

表1 常用高脂細(xì)胞建模方法Table 1 Common hyperlipidemia cell modeling method

2.2 小鼠

小鼠因價(jià)格便宜、易于飼養(yǎng)、造模成本低、血脂穩(wěn)定和采樣方便等優(yōu)點(diǎn)，也被廣泛運(yùn)用于篩選降脂中藥的實(shí)驗(yàn)研究中。但是，小鼠能采集的血量少，極大程度的限制了相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。此外，小鼠血漿中不含血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白[25](cholesteryl ester transfer protein，CETP)，對(duì)飲食中的膽固醇和高糖無(wú)反應(yīng)，很難繼續(xù)發(fā)展為AS，因此，只能單純的用于HLP研究。

近年來(lái)，C57BL小鼠和敲除了與脂蛋白代謝相關(guān)蛋白的小鼠被大量應(yīng)用于復(fù)制高脂模型。與建立高脂大鼠模型相似，建立高脂小鼠模型時(shí)，高脂飼料喂養(yǎng)法和灌胃法也是常用方法。此外，自從第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠制備成功，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型也被廣泛用于HLP和AS的研究。長(zhǎng)期用高脂飼料喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠，可導(dǎo)致血脂異常、肥胖和2型糖尿病等疾病[26]。Saravanan等[27]連續(xù)用高脂飼料(脂肪含量35.8%)對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行為期70 d的造模飼養(yǎng)，利用此模型評(píng)估一種單萜酚類(lèi)化合物百里酚對(duì)高脂血癥、2型糖尿病的作用。結(jié)果表明，40 mg/kg的百里酚具有良好的抗高脂血癥、高血糖的作用，可保護(hù)C57BL/6J小鼠免受HFD的侵襲。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)連續(xù)28 d給小鼠灌胃1，3-二氯丙醇，可以通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路來(lái)誘發(fā)HLP。Lu等[28]通過(guò)此種方法成功復(fù)制高脂小鼠模型，且還發(fā)現(xiàn)HDL-c的降低程度與1，3-二氯丙醇呈一定的劑量依耐性。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種多態(tài)性蛋白，能調(diào)節(jié)脂代謝有關(guān)酶的活性，參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化和代謝過(guò)程。ApoE主要存在于乳糜顆粒、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)和部分HDL中，對(duì)ApoE基因多態(tài)性的研究也是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。ApoE變異或者缺失，會(huì)導(dǎo)致血脂代謝紊亂和AS等疾病。Patterson等[29]利用基因靶向技術(shù)，制備了ApoE-/-轉(zhuǎn)基因小鼠，用于研究瑞舒伐他汀對(duì)ApoE基因缺失小鼠高脂血癥深靜脈血栓的影響。與正常小鼠相比，ApoE-/-小鼠的TC升高4倍，TG升高2倍。在正常飲食下，即可形成高膽固醇血癥，在高脂高膽固醇飲食下，可加速AS的病變發(fā)生。由此可見(jiàn)，利用基因靶向技術(shù)所制備的轉(zhuǎn)基因小鼠可大大節(jié)約造模時(shí)間。

2.3 家兔

家兔的脂蛋白代謝與人類(lèi)相似，血漿中具有豐富的CETP，不具有肝ApoB mRNA編輯活性[30]，對(duì)外源性膽固醇吸收率高，血中脂質(zhì)清除率低，是研究人類(lèi)脂質(zhì)代謝和AS最常用的動(dòng)物模型，同時(shí)也是最早被用于復(fù)制HLP和AS模型的動(dòng)物。又因家兔肝脂酶活性較低，不需要格外添加任何誘導(dǎo)劑，單純飼喂高膽固醇飼料即可快速發(fā)展成HLP和AS，其TC在一個(gè)月可升高11.8倍，在兩個(gè)月可升高17.7倍[31]。因此，家兔提供了一個(gè)獨(dú)特的系統(tǒng)來(lái)研究膳食膽固醇對(duì)高膽固醇血癥、AS和肝功能障礙的影響[32]。

相比于大鼠和小鼠，家兔對(duì)高膽固醇食物顯得尤為敏感。大多數(shù)HLP和AS兔模型都是通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)所得到。Heikal等[33]采用HFD(含1%膽固醇)對(duì)雄性新西蘭家兔喂養(yǎng)8周，成功造成高血脂家兔模型，用于研究非布索坦的抗高脂血癥的作用及作用機(jī)制?；蚯贸秊檠芯恐|(zhì)代謝提供了另一種制備兔模型的方法，但即便如此，ApoE-/-兔仍需要飼喂高膽固醇飼料才能誘導(dǎo)高脂血癥。最近Lu等[34]使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)錨定低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)外顯子7，試圖產(chǎn)生一種可自發(fā)形成HLP的LDLR-KO兔。結(jié)果顯示，LDLR-KO兔在正常的飲食下均可自發(fā)性誘導(dǎo)高膽固醇血癥和AS。提示LDLR-KO家兔可以作為研究高膽固醇血和AS的模型，用于模擬人類(lèi)原發(fā)性高膽固醇血癥，使心腦血管病的研究更加精確。

2.4 豚鼠

有研究表明[35]，豚鼠的脂蛋白代謝與人類(lèi)的代謝有顯著的相似之處。與人類(lèi)一樣，豚鼠也是少數(shù)幾種LDL-c含量最高的物種之一。其相似主要體現(xiàn)在LDL/HDL比值高、肝中游離膽固醇濃度高于酯化膽固醇、肝膽固醇合成、酯化和分解代謝很相似等[36]。豚鼠性情溫順，采血量大，對(duì)TC的敏感性高于大鼠[37]。此外，切除卵巢的豚鼠還可以較好地模擬絕經(jīng)后女性的脂蛋白代謝[38]。

豚鼠對(duì)高脂飼料、高膽固醇飼料顯得尤為敏感，通常在普通飼料中添加少量的膽固醇便可造成高膽固醇血癥。Yang等[39]采用高脂飼料(添加5%的豬油和0.3%的膽固醇)飼喂豚鼠，14周后測(cè)定血脂、ApoB100、MDA、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮含量。對(duì)主動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)行組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示，模型組TC、TG、LDL-c、ApoB100水平是對(duì)照組的9.45倍、6.01倍、12.72倍、14倍，模型組HDL-c相比與對(duì)照組顯著降低72%，出現(xiàn)嚴(yán)重血脂異常，且模型組MDA含量高于對(duì)照組8.2倍，SOD活性降低60.8%，并伴有組織學(xué)改變和內(nèi)皮功能障礙。由此可見(jiàn)，豚鼠也是一種比較理想的研究脂代謝的模型動(dòng)物。

此外，用來(lái)復(fù)制高脂模型的動(dòng)物還有長(zhǎng)爪沙鼠[40]、金黃地鼠[41]、食蟹猴[42]、懸猴、鵪鶉、雞、家鴨、beagle犬、五指山小型豬和鴿子等，研究者應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

常用高脂哺乳動(dòng)物模型的比較見(jiàn)表2。

3 高脂斑馬魚(yú)模型

斑馬魚(yú)是一種原產(chǎn)于南非地區(qū)的熱帶硬骨魚(yú)，因其基因組序列與人類(lèi)有著87%的高度相似性[43]，體積小，胚胎透明，易于大規(guī)模飼養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)周期短，被廣泛作為高通量篩選藥物的經(jīng)典模型[44-45]。又因其血脂構(gòu)成、脂質(zhì)吸收、脂質(zhì)代謝、器官和組織與人類(lèi)基本一致，近年來(lái)被大量應(yīng)用在與脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)異常相關(guān)的疾病研究中，如HLP、糖尿病、脂肪肝、AS等，是研究單體中藥降血脂作用的理想模式生物[46]。

3.1 斑馬魚(yú)幼魚(yú)

Stoletov等[47]利用斑馬魚(yú)幼魚(yú)身體透明、器官清晰可見(jiàn)和能夠以高分辨率在體內(nèi)對(duì)器官和生物過(guò)程進(jìn)行非侵入性的可視化的特性，對(duì)活體高膽固醇血癥斑馬魚(yú)幼魚(yú)的血管脂質(zhì)堆積、脂蛋白氧化和脂肪條紋的形成情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)的研究報(bào)道。該團(tuán)隊(duì)在高膽固醇飼料中添加一種紅色的Cholesteryl BODIPY 576/589 C11活體熒光探針，用來(lái)牢固標(biāo)

記幼魚(yú)體內(nèi)的膽固醇，以便在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)活體斑馬魚(yú)中的膽固醇走向以及在血管壁內(nèi)的沉積進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀(guān)察。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)出穩(wěn)定的紅色熒光磷脂堆積、血管脂質(zhì)大量沉積、脂肪條紋形成，表明高膽固醇血癥模型成功建立。但是，由于這種活體熒光探針價(jià)格昂貴，容易猝滅，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高、結(jié)果不穩(wěn)定和重現(xiàn)性差，后來(lái)Zhou等[48]建立了一種可以快速高通量篩選降脂藥物的斑馬魚(yú)高脂模型。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)5 dpf(days post fertilization，dpf)斑馬魚(yú)幼魚(yú)喂養(yǎng)0.1%的蛋黃粉24 h和48 h，對(duì)斑馬魚(yú)尾靜脈油紅O染色，對(duì)其在解剖立體顯微鏡下成像所得到的圖片進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的腸道和血管中的脂質(zhì)會(huì)隨著時(shí)間的增加而堆積，快速建立了斑馬魚(yú)HLP模型，并且該團(tuán)隊(duì)利用這模型對(duì)幾種常見(jiàn)的不同作用機(jī)制的降血脂藥物進(jìn)行了篩選和療效評(píng)價(jià)。后來(lái)，余琳媛等[49]采用這種造模方法來(lái)篩選傳統(tǒng)降脂中藥制首烏中具有降脂保肝作用的有效化學(xué)成分。結(jié)果顯示，大黃素能顯著降低斑馬魚(yú)的死亡率，降低TG水平，可明顯改善斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝脂質(zhì)的沉積，由此推測(cè)制首烏中具有降脂作用的主要有效成分是大黃素。

表2 常用高脂哺乳動(dòng)物模型比較Table 2 Comparison of commonly used hyperlipidemia mammal models

3.2 斑馬魚(yú)成魚(yú)

由于斑馬魚(yú)幼魚(yú)HLP模型的檢測(cè)指標(biāo)大多都是通過(guò)油紅O染色和活體熒光探針來(lái)反應(yīng)，這些都是間接地反應(yīng)血脂的相對(duì)變化，不能真實(shí)地反映出機(jī)體的脂質(zhì)代謝情況，況且從斑馬魚(yú)幼魚(yú)中提取血液也是不切實(shí)際的。但是，可以通過(guò)抽取斑馬魚(yú)成魚(yú)的血漿來(lái)直接檢測(cè)血脂的變化情況[50]。韓冰等[51]用含4%膽固醇飼料去喂養(yǎng)3月大的斑馬魚(yú)成魚(yú)20 d，通過(guò)對(duì)肝進(jìn)行油紅O染色和測(cè)定血清TC、TG和LDL-c含量與空白組相對(duì)比，其結(jié)果顯示高膽固醇組的血清TC、TG和LDL-c含量均有顯著性升高，肝中出現(xiàn)大量的脂肪滴累積，表明成功建立高脂斑馬魚(yú)成魚(yú)模型，為下一步研究和開(kāi)發(fā)新的降血脂中藥奠定基礎(chǔ)。

高脂斑馬魚(yú)幼魚(yú)和成魚(yú)造模方法的比較見(jiàn)表3。

4 高脂模型在篩選降脂中藥中的作用

長(zhǎng)期高脂高膽固醇飲食會(huì)打破機(jī)體脂質(zhì)吸收和消化之間的平衡關(guān)系，導(dǎo)致脂肪、膽固醇和復(fù)合糖類(lèi)長(zhǎng)期大量的在血管內(nèi)壁上聚集和過(guò)度沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚變硬，血管腔變窄，致使動(dòng)脈內(nèi)膜形成粥樣斑塊，影響血流速度，進(jìn)而產(chǎn)生一系列更為嚴(yán)重的心血管疾病。因此，及早進(jìn)行預(yù)防和篩選有效的降脂藥是降低患者心血管事件發(fā)生的有效控制手段。目前對(duì)于HLP的治療首選他汀類(lèi)藥物，但是如果長(zhǎng)期服用調(diào)血脂西藥，其以轉(zhuǎn)氨酶升高為特征的肝損害和以肌酸激酶升高為特征的橫機(jī)紋溶解等副作用會(huì)逐漸凸顯出來(lái)。因此，一些天然產(chǎn)物，特別是我國(guó)具有悠久的歷史和顯著的療效的傳統(tǒng)降脂中藥，因具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)、療效好、毒副小等的優(yōu)點(diǎn)，可以很好地與西藥作用的單一性相彌補(bǔ)而受到了格外的關(guān)注。因此，建立可用于篩選和研究降血脂中藥的脂質(zhì)代謝紊亂動(dòng)物模型顯得尤為重要。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，HLP的病因病機(jī)主要是恣食肥甘，痰濁淤阻引起。運(yùn)用傳統(tǒng)中藥來(lái)預(yù)防和治療HLP，主要是依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的辨證論治，故篩選和研究降脂中藥時(shí)需要根據(jù)其病因病機(jī)及證候選擇不同的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)復(fù)制高脂模型[52]。目前，已有很多學(xué)者通過(guò)不同的高脂模型篩選出具有調(diào)血脂作用的中藥。如何首烏[49]、柴胡[53]、天麻[54]、虎杖[55]、決明子[56]等，具有降血脂、降血壓、抗脂肪肝、抗AS等功效，可用于治療高血壓、HLP、AS等疾病。隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，我國(guó)對(duì)HLP的治療不但可以從中醫(yī)的證候表征入手，還可以結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥理論知識(shí)從基因蛋白水平治療HLP。

理想的降脂模型不單單有助于篩選降脂中藥和其機(jī)制的研究，還應(yīng)該有助于HLP中醫(yī)發(fā)病機(jī)理的研究，只有明白機(jī)理才能準(zhǔn)確的選擇相應(yīng)的治法和藥物。但是，我國(guó)暫時(shí)還沒(méi)有大規(guī)模、多中心、深層次的研究，以及我國(guó)中藥成分的多樣性和中醫(yī)理論的復(fù)雜性，目前還未徹底了解其發(fā)揮療效的具體機(jī)制和HLP的中醫(yī)發(fā)病機(jī)理。因此，對(duì)于降血脂模型的建立，還需要我們不斷改進(jìn)、完善和創(chuàng)新，以尋求更完美的生物模型，更加深入全面地闡明HLP的發(fā)病機(jī)理和降脂中藥的治療機(jī)制。

5 結(jié)語(yǔ)和展望

綜上所述，目前有多種多樣的方法來(lái)建立HLP模型，各種模型均有其優(yōu)缺點(diǎn)。高脂細(xì)胞模型相對(duì)于其他模型，具有實(shí)驗(yàn)周期短、可控性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但生物體終究是一個(gè)有機(jī)整體，其各個(gè)組織器官之間都存在著聯(lián)系，單純用細(xì)胞模型來(lái)研究只能說(shuō)明藥物是對(duì)這種細(xì)胞的作用效果，無(wú)法代替整個(gè)有機(jī)體。而動(dòng)物模型即可以用來(lái)探討降脂中藥對(duì)整個(gè)機(jī)體的作用機(jī)制，特別其斑馬魚(yú)模型還可以高效、快速的進(jìn)行高通量篩選。因此，我們應(yīng)該將細(xì)胞模型與動(dòng)物模型緊密結(jié)合起來(lái)，使兩種模型相互補(bǔ)充，共同促進(jìn)對(duì)HLP發(fā)病機(jī)制及防治中藥的研究。

表3 高脂斑馬魚(yú)造模方法比較Table 3 Comparison of modeling methods for hyperlipidemia zebrafish

復(fù)制的高脂模型成功與失敗，受到了多種因素的制約。飼喂方式的不同(飼喂法和灌胃法)、高脂飼料占比的不同以及脂肪乳劑配方的不同，都會(huì)影響造模的成功率。此外，影響造模效果的因素還有動(dòng)物的品系、性別和年齡等。在建立高脂動(dòng)物模型時(shí)，一般多選用雄性動(dòng)物。因HLP的發(fā)生與腎上腺素等激素有關(guān)，而雄性動(dòng)物較雌性動(dòng)物競(jìng)爭(zhēng)更為激烈，所以雄性動(dòng)物更易形成HLP。所以應(yīng)該根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況，選擇合適的HLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

隨著新理論、新技術(shù)和新概念的出現(xiàn)，人們對(duì)高脂模型的要求隨之提高。研究人員在進(jìn)行研究時(shí)必須謹(jǐn)慎，因?yàn)槟承┠Ｐ偷闹|(zhì)代謝可能被證明與人類(lèi)完全不同，因此，可能不適合研究降血脂中藥的作用機(jī)制。筆者認(rèn)為，在眾多的模型中挑選出適合于研究HLP的模型時(shí)，需要結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)的目的、指標(biāo)和經(jīng)費(fèi)等客觀(guān)條件，特別要著重注意以下幾點(diǎn)。第一，選擇建立的模型應(yīng)盡可能與人類(lèi)疾病相符合；第二，盡量選用自身影響因素小的模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好是可以多次重現(xiàn)，以避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性和不精確性；第三，應(yīng)注意選擇模型的實(shí)用性、經(jīng)濟(jì)型和可操作性。筆者相信，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究手段，中醫(yī)藥治療HLP將會(huì)有更加廣闊的發(fā)展前景。