血管內皮生長因子失衡及補體沉積與先兆子癇的相關性研究

于 穎，路鴻艷

(淄博市婦幼保健院產科，山東 淄博 255000)

先兆子癇(preeclampsia，PE)是胎盤功能障礙的常見表現，呈現為妊娠20周后出現的高血壓，并伴有腎功能不全，肝功能異常，神經癥狀，血小板減少其中一項或者多項癥狀[1]。先兆子癇在妊娠婦女中發(fā)病率高達8%，會導致胎兒的生長受限和早產，以及孕產婦長期的高血壓等心血管疾病，已經成為導致全球孕產婦和新生兒死亡的主要原因之一[2-3]。

補體系統(tǒng)是天然免疫反應的關鍵組成部分，補體的過度激活會增加全身性炎癥反應，發(fā)生類似PE的母體癥狀[4]，并且在PE患者的胎盤內檢測到補體系統(tǒng)的過度激活和異常表達的補體蛋白[5]；此外有研究發(fā)現妊娠20周前血清補體B、C3a和C5a水平的異常升高與PE的發(fā)病具有相關性[6]。

妊娠期子宮和胎盤中新生血管的生長主要由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)介導調控，可溶性抗血管生成因子受體(antiangiogenic soluble VEGF receptor 1，sFlt-1)能夠與VEGF和PIGF發(fā)生結合后拮抗其促進血管生成的作用[7]。在PE患者的循環(huán)血液中可以觀察到sFlt-1水平的升高及VEGF和PlGF的降低，并且動物實驗發(fā)現:在小鼠妊娠中期外源性給予sFlt-1蛋白可以誘導PE的發(fā)生[8]。表明VEGF家族的異常信號傳導在胎盤疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用[9]。但是血管生成因子平衡的紊亂和異常的補體信號活化在早期妊娠和PE的致病過程中發(fā)揮怎樣具體的分子調控機制一直缺乏深入的研究，本項研究通過構建PE的小鼠模型，探究血管內皮生長因子失衡和異常補體免疫激活在早期妊娠的蛻膜和胎盤形成中的作用，闡明其與先兆子癇發(fā)病之間的關系?，F將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇近交系6～8周齡/雌性，SPF級BPH-5小鼠作為先兆子癇的模型動物[7]，共30只，體重18～22 g，購自成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2015-0030]，選擇6～8周齡/雌性，SPF級C57小鼠作為對照動物，共30只，每只體重18～22 g，購自川北醫(yī)學院[SCXK(川)2018-0030]。所有動物飼養(yǎng)于本醫(yī)院的實驗動物中心[SYXK(魯)2018-0025]，給與自由飲食和交配。觀察到母鼠懷孕的首天定義為E0.5 d。收集E5.5 d和E7.5 d的懷孕母鼠的子宮以及E10.5 d的胎盤，儲存在-80℃冰箱用于后續(xù)實驗。所有動物實驗內容符合醫(yī)院實驗動物倫理和保護指南，倫理審批號IACUC:2018ZF017X，全部實驗內容遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒(貨號∶142579，購自德國Qiagen公司)；TRIzol(貨號∶15596018，購自美國Invitrogen公司)；4%甲醛固定液(貨號∶BWZ6716-2016)和無水乙醇(貨號∶YA13223000ME)(均購自國藥集團化學試劑有限公司)；30% H2O2溶液(貨號∶ZLI-9311，購自北京中杉金橋有限公司)；大鼠抗小鼠C3單克隆抗體(貨號∶sc-58926，購自美國Santa Ana公司)；大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體(貨號∶sc-46694，購自美國Santa Ana公司)；用于IF的二級抗體是Alexa Fluor 594(貨號∶C10639)和Alexa Fluor 488(貨號∶A10266)(購自美國Thermo Fisher公司)；兔抗鼠C9單克隆抗體(貨號∶PAB823Mu01，購自Cloud-Clone公司)；大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體(貨號∶550274，購自美國BD生物公司)和山羊抗小鼠VEGFR2單克隆抗體(貨號∶AF644，購自美國R＆D Systems公司)；用于免疫組化檢測的二級抗體是生物素兔抗山羊IgG(貨號∶sc-3919)、生物素山羊抗兔IgG(貨號∶sc-2004)和生物素兔抗鼠IgG(貨號∶sc-358926)(購自美國Santa Ana公司)；DAB顯色試劑盒(貨號∶ZLI-9018，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；SYBR Green酶(貨號∶208054，購自美國Qiagen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量PCR檢測目的基因的表達水平

從胎盤植入部位的子宮和胎盤組織中提取總RNA，合成cDNA，用SYBR Green酶進行定量RTPCR檢測基因表達情況。每個樣本進行3次重復，計算目標基因的相對表達水平。

1.3.2 免疫熒光和免疫組化檢測

選胎盤植入部位的子宮和胎盤組織用于組織學染色，將標本在4℃的4%多聚甲醛中固定，30%蔗糖的PBS溶液浸泡后，包埋于OCT化合物中，用冷凍切片機切成7 mm薄片。隨機選擇5只BPH-5小鼠和C57對照小鼠子宮的胎盤植入部位及胎盤組織進行免疫熒光和免疫組化染色，觀察組織內C3補體、C9補體、VEGFR2、CD31的原位表達情況。具體步驟:脫蠟，1 mmol/L的EDTA緩沖液中微波加熱行抗原修復，3% H2O2室溫孵育10 min，5% BSA封閉20 min，滴加一抗4℃孵育過夜，加HRP標記的二抗37℃孵育60 min，以上各步驟結束時均用PBS洗3次，每次5 min，然后加DAB溶液顯色10 min，最后蘇木精或亞甲基綠復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下讀片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量累積光密度值(IOD)，對目的蛋白的表達進行半定量分析。

1.3.3 組織學分析

免疫熒光切片采用Nikon A1掃描共聚焦顯微鏡和Image J軟件進行圖像觀察和分析。免疫組化切片采用Nikon Microphot-FXA顯微鏡和NISElements D 3.10軟件進行圖像觀察和分析。由三位研究者獨立測量陽性細胞的染色面積，計算其與切片中滋養(yǎng)層巨細胞(TGC)總面積的比值定義為陽性率，并取3位觀察者的平均值。

1.3.4 Western blot檢測目的蛋白表達水平

使用RIPA裂解緩沖液提取關節(jié)軟骨細胞中的總蛋白，Western blot法檢測目的蛋白表達量。具體步驟如下:以BCA法測定總蛋白濃度，95℃變性5 min后，以15% SDS-凝膠進行電泳分離，隨后將目的蛋白以濕轉法轉移至PVDF膜上；5% BSA-TBST溶液封閉1 h；5% BSA-TBST稀釋一抗，置于4℃水平搖床孵育過夜；次日使用TBST洗膜3次，每次10 min；5% BSA-TBST稀釋二抗，室溫孵育40 min；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL顯色液曝光顯影。Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定目的條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據處理和統(tǒng)計分析，計量資料表述為以平均數±標準差(±s)，兩組間比較采用student-t檢，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蛻膜化高峰期在BPH-5小鼠的蛻膜血管中出現補體的表達增加

我們通過qRT-PCR和免疫染色檢測了BPH-5小鼠在蛻膜化高峰期E7.5 d時特異性補體成分的表達情況。如圖1所示，E7.5 d BPH-5小鼠和C57小鼠的胎盤植入部位檢測到補體C1qa的mRNA表達量相當，但補體C3和CfB的mRNA表達量在BPH-5小鼠中顯著增加。

進一步我們對E7.5 d子宮內胎盤植入部位的組織進行了補體C3和內皮細胞標記CD31的免疫熒光染色。觀察到在BPH-5小鼠的子宮植入部位的組織中補體C3表達顯著增加，并且在外胎盤錐中檢測到補體C3的沉積(圖2中用虛線黃線突出顯示)。C3與CD31的熒光共定位圖像顯示BPH-5小鼠的補體C3主要沉積在妊娠后的蛻膜血管周圍(圖3)，根據CTCF測定值證實:PE小鼠的胎盤植入部位的血管周圍會出現顯著增加的補體C3沉積。

2.2 妊娠中期胎盤的TGC層中補體的表達顯著增加

注:*P＜0.05，**P＜0.001。圖1 qRT-PCR分析E7.5 d C57和BPH-5孕鼠的植入部位補體C1qa、C3和CfB mRNA的表達Note.*P＜0.05，**P＜0.001.Figure 1 The mRNA of complements C1qa，C3 and CfB in the implantation site of C57 and BPH-5 pregnant mice were analyzed by qRT-PCR

我們檢測E10.5 d即妊娠中期胎盤中補體的表達情況，發(fā)現BPH-5小鼠和C57小鼠的胎盤組織中補體C1qA和CfB的mRNA的表達量相當，但補體C3在BPH-5小鼠中的表達顯著增加(圖4)。并且免疫組化染色證實在BPH-5小鼠的胎盤中C3和C9沉積增加，陽性染色定位于TGC層(圖5、6)。

2.3 BPH-5小鼠的植入部位在胎盤形成之前已經存在血管內皮生長因子表達的失衡

注:細胞核用DAPI染色(藍色)，C3陽性染色為紅色。在C57和BPH-5植入部位的外胎盤錐體(虛線和胚胎之間的區(qū)域)和蛻膜血管系統(tǒng)(箭頭)周圍檢測到補體C3的沉積。e:胚胎。圖2 選擇E7.5 d植入部位的組織進行免疫熒光染色Note.The nucleus was stained with DAPI(blue)and C3 positive staining was red.The deposition of complement C3 was detected around the external placental cone(the area between the dotted line and the embryo)and the decidual vascular system(arrowhead)of the C57 and BPH-5 implantation sites.e，embryo.Figure 2 The immunofluorescence staining of tissues implanted on E7.5 d

注:v:血管。圖3 對E7.5 d植入部位的組織進行補體C3和CD31的免疫熒光雙染Note.v，blood vessel.Figure 3 C3 and CD31 immunofluorescence staining of the tissues implanted on E7.5 d，and the decidual blood vessels were marked with CD31

注:**P＜0.001。圖4 qRT-PCR檢測E10.5 d時C57和BPH-5胎盤組織中補體成分C1qa、C3和CfB mRNA的表達Note.**P＜0.001.Figure 4 The expression of complement components C1qa，C3 and CfB mRNA in placental tissue of C57 and BPH-5 was detected by qRT-PCR

如圖7所示，在著床期和蛻膜化開始時期，BPH-5小鼠和C57小鼠補體C1qA、C3和CfB的mRNA的表達量相當。但BPH-5小鼠中VEGFa的mRNA顯著上調，VEGFR1和VEGFR2的mRNA表達下調。蛻膜化高峰期，在BPH-5小鼠的植入部位VEGFa的mRNA表達呈上升趨勢。免疫印跡檢測證實BPH-5小鼠植入部位的VEGF蛋白表達量也隨之顯著增加(圖8)。這些數據顯示BPH-5小鼠在妊娠早期發(fā)生補體異常沉積之前就會出現VEGF基因家族的表達異常。

2.4 BPH-5小鼠的植入部位呈現蛻膜血管的異常

因為在E5.5和E7.5 d的BPH-5小鼠中觀察到VEGF家族成員的表達異常，我們進一步檢測蛻膜血管是否會隨之發(fā)生改變。評估E7.5 d在BPH-5小鼠和C57小鼠的植入部位蛻膜血管系統(tǒng)的發(fā)育情況，測量蛻膜毛細血管管腔面積與蛻膜總面積比值進行組間比較。與C57對照小鼠相比，BPH-5小鼠的蛻膜比率明顯降低(圖9)，提示在BPH-5小鼠的妊娠過程中，著床后的蛻膜血管生成受到明顯抑制。

注:紅色星號∶胎盤TGC層；黃色箭頭:陽性染色。圖5 免疫組化檢測E10.5 d時C57和BPH-5胎盤組織中補體C3和C9的組織沉積Note.Red asterisk，placental TGC layer.Yellow arrow，positive staining.Figure 5 The deposition of complement C3 and C9 in placental tissue of C57 and BPH-5 was detected by immunohistochemistry

注:**P＜0.001。圖6 定量評估BPH-5和C57小鼠的胎盤TGC層中C3和C9沉積量Note.**P＜0.001.Figure 6 The deposition of C3 and C9 in placental TGC layer of BPH-5 and C57 mice was quantitatively evaluated

注:*P＜0.05，n＝5。圖7 qRT-PCR檢測E5.5 d的C57小鼠和BPH-5小鼠植入部位的補體和血管內皮生長因子基因的表達情況Note.*P＜0.05，n＝5.Figure 7 The expression of complement and vascular endothelial growth factor gene in the implanted site of C57 mice and BPH-5 mice were detected by qRT-PCR

2.5 妊娠中期BPH-5胎盤中呈現血管生成因子的表達失衡

分析BPH-5小鼠小鼠的胎盤組織中血管生成相關基因在E10.5 d時的表達情況。與C57對照組相比，BPH-5小鼠的胎盤組織中促血管生成的VEGFa、PlGF和RGC32基因的mRNA表達顯著降低，而抗血管生成因子sFlt-1mRNA的mRNA表達上調(圖10)。

3 討論

我們的研究以BPH-5小鼠為PE的模型動物，首次發(fā)現在PE的致病過程中，血管內皮生長因子的失衡先于母胎界面補體成分的增加而出現明顯變化，并且妊娠母體子宮內的分子變化先于胎盤發(fā)生，最終推動母體PE病情的進展。

圖8 免疫印跡檢測C57小鼠和BPH-5小鼠植入部位的VEGF蛋白表達量Figure 8 The expression of VEGF protein in the implanted site of C57 mice and BPH-5 mice was detected by immunoblotting

我們發(fā)現在BPH-5小鼠的蛻膜化高峰期的胎盤植入部位中補體C3和CfB水平均顯著升高。一直以來的研究認為補體C3和CfB的異常激活與不良妊娠結局具有相關性[10]，這與我們的研究結果具有一致性。我們觀察到的在E7.5 d的外胎盤錐中出現過量的補體C3沉積，在妊娠中期胎盤的TGC層中補體C9的水平顯著增加，而C9是所有補體途徑形成最終補體效應復合物的共同組成部分[10]。這些發(fā)現表明:BPH-5小鼠妊娠早期局部補體通路的異常激活是啟動PE發(fā)生發(fā)展的重要因素。

我們的研究進一步深入挖掘了BPH-5小鼠妊娠中補體過度沉積與VEGF家族基因表達異常之間的關系，發(fā)現在BPH-5小鼠的蛻膜化開始時期，補體系統(tǒng)異常激活之前，VEGF家族包括VEGF，PlGF，VEGFR1，VEGFR2和sFlt-1就已經出現了異常表達[11]，這些基因的表達與蛻膜血管生成，胎盤生長及PE的發(fā)病密切相關[12]。在小鼠中，VEGF在子宮內膜和種植后的蛻膜中表達較高，激活VEGF受體VEGFR1和VEGFR2可以促進蛻膜血管生成[13-14]。

注:以VEGFR2指示新生蛻膜毛細血管，紅色箭頭指示毛細血管；e:胚胎。圖9 免疫組化檢測E7.5 d時蛻膜血管中VEGFR2的表達Note.VEGFR2 was used to indicate new decidual capillaries and red arrows were used to indicate capillaries.e:embryo.Figure 9 The expression of VEGFR2 in decidual blood vessels was detected by immunohistochemistry

注:*P＜0.05，**P＜0.001，n＝5。圖10 qRT-PCR監(jiān)測妊娠中期E10.5 d時胎盤中血管內皮生長因子相關基因的mRNA表達情況Note.*P＜0.05，**P＜0.001，n＝5.Figure 10 qRT-PCR was used to monitor the mRNA expression of vascular endothelial growth factor-related genes in placenta at E10.5 d in the second trimester of pregnancy

我們的數據表明，在E5.5 d的BPH-5妊娠小鼠中VEGFR1和VEGFR2表達明顯降低，這導致機體內形成了抗血管生成環(huán)境，抑制蛻膜血管系統(tǒng)的發(fā)育。在E7.5 d，血管間隙減少和促血管生成配體VEGFA和PlGF的表達增加，后者可能與機體的反饋調節(jié)機制有關，以響應和對抗機體的抗血管生成狀態(tài)[15]。在這個過程中，血管密度的降低導致機體的局部缺氧環(huán)境，進而誘導VEGFA的表達。這種蛻膜血管系統(tǒng)的異常發(fā)育和局部VEGF家族基因的異常表達先于sFlt-1在BPH-5小鼠胎盤中的表達增高和補體的異常沉積。此外，我們在BPH-5妊娠小鼠中成功捕捉到蛻膜血管系統(tǒng)的明顯異常，血管周圍有過量的補體沉積?；谝陨习l(fā)現，我們認為異常的蛻膜血管生成是觸發(fā)補體系統(tǒng)異常激活的早期因素，進而觸發(fā)機體發(fā)生一系列有害的連鎖反應，如滋養(yǎng)細胞侵入母體螺旋動脈，即發(fā)生PE第一階段的病理改變。我們的后續(xù)研究著重探尋早期血管內皮生長因子失衡在BPH-5孕鼠胎盤植入過程中發(fā)揮的具體作用機制和細胞學基礎，以及如何有效遏制母胎界面補體的過度激活，進而遏制PE病情的早期進展。

綜上所述，我們的研究成功證實了蛻膜血管內皮生長因子失衡先于補體系統(tǒng)的異常激活發(fā)生，而補體系統(tǒng)的激活反過來又會導致異常滋養(yǎng)細胞侵襲和胎盤的不良發(fā)育，這是導致PE發(fā)病的重要分子基礎，針對這一機制的研究證據有望為臨床PE的治療探索出早期干預靶點。