小鼠急性肝損傷對棕色脂肪組織功能的影響及機(jī)制研究

馮 妙，卜浩林，李麗紅，郭林芝，苗宇船，郭建紅*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619)

嚙齒動物體內(nèi)的脂肪組織分為白色、米色和棕色脂肪組織，三種脂肪組織相互協(xié)同以確保嚙齒動物維持最佳代謝狀態(tài)，當(dāng)它們出現(xiàn)功能失調(diào)時，就會導(dǎo)致胰島素抵抗和相關(guān)的代謝并發(fā)癥，從而損害機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)[1]。白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)是一種儲能組織，能快速動員以提供其他組織的能量需求；米色和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)是一種耗能組織，通過其線粒體上解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)的作用，使能量以熱量的形式釋放[2]。很多證據(jù)表明棕色脂肪組織的移植或活化逆轉(zhuǎn)了肥胖并改善了胰島素敏感性[3-4]，因此，棕色脂肪組織是治療代謝綜合征的潛在目標(biāo)[5]。

肝是新陳代謝的主要器官，它執(zhí)行全身代謝穩(wěn)態(tài)所需的多種生化功能，尤其在脂質(zhì)代謝中起著重要作用。肝吸收血清中的游離脂肪酸、合成和輸出脂質(zhì)和脂蛋白。在肝細(xì)胞中，游離脂肪酸可以通過β氧化生成ATP；也可以酯化生成甘油三酯，這些甘油三酯以極低密度脂蛋白的形式釋放到血液中，運(yùn)輸至脂肪組織儲存[6-7]。作為全身代謝的主要參與者，肝與脂肪組織緊密相連，肝通過調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物影響脂質(zhì)的儲存和代謝；另外，肝源性調(diào)節(jié)分子也會影響脂肪組織的炎癥和胰島素抵抗[8]，然而肝對棕色脂肪組織功能的影響尚不明確。本研究通過用25% CCl4制備小鼠急性肝損傷模型，在不同時間點(diǎn)觀察棕色脂肪組織的變化，探討急性肝損傷對棕色脂肪組織功能的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級8周齡C57BL/6雄性小鼠18只，體重19.5～20.5 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(湘)2014-0011]。所有動物在本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立動物房飼養(yǎng)[SYXK(晉)2015-0001]，室溫(22±1)℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由獲取食物和水。動物的使用及操作按照本校動物管理委員會(IACUC2017-001)的規(guī)定執(zhí)行，在使用動物的過程中充分考慮動物福利3R原則，最大程度減少對動物的傷害和痛苦。

1.2 主要試劑與儀器

CCl4(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，中國)；RNAiso Plus(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，9108/9109，中國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR047A，中國)；TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR820A，中國)；UCP1抗體(Abcam公司，ab10983，英國)；聚合HRP標(biāo)記抗兔/鼠IgG(BOSTER，SVOOO4，中國)；DAB顯色液(索萊寶生物科技有限公司，20190307，中國)；Ucp1引物、β-actin引物(華大基因，中國)；AST ELISA試劑盒(江萊生物，JL13939，中國)；ALT ELISA試劑盒(江萊生物，JL13983，中國)；TNF-α ELISA試劑盒(江萊生物，JL10484，中國)；酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司，SpectraMAX190，美國)；離心機(jī)(eppendorf公司，eppendorf 5804R，德國)；實(shí)時定量PCR反應(yīng)儀(杭州博日科技有限公司，F(xiàn)QD-96a，中國)；包埋機(jī)(Leica公司，Leica EG 1150 H，德國)；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(奧林巴斯株式會社，Olympus IX71，日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組與處理

將18只8周齡C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組(n＝6)、CCl42周組(n＝6)和CCl44周組(n＝6)。CCl4和橄欖油根據(jù)體積比配置成25% CCl4溶液。CCl4組腹腔注射(ip)25% CCl4，劑量為每3 d 0.1 mL/10 g，共2次；對照組給予同等劑量的橄欖油。所有小鼠飼以普通飼料和飲用水。分別在2周末和4周末經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠后心臟采血，取肝和棕色脂肪組織，稱重棕色脂肪組織。

1.3.2 HE染色

取部分肝和棕色脂肪組織置于10%福爾馬林溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片(切片厚度為4μm)，行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.3.3 免疫組織化學(xué)

棕色脂肪組織石蠟包埋切片(切片厚度為4 μm)，切片常規(guī)脫蠟至水，微波爐中高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2溶液孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA溶液37℃封閉30 min，一抗孵育(UCP1抗體濃度為1∶500)，4℃過夜，次日滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔/小鼠IgG，37℃孵育30 min，DAB顯色適當(dāng)時間(顯微鏡下出現(xiàn)陽性顆粒)，蘇木素復(fù)染30 s，中性樹膠封片。

1.3.4 實(shí)時定量PCR

取部分棕色脂肪組織，用液氮充分研磨，根據(jù)試劑盒說明書，使用RNAiso Plus試劑提取棕色脂肪組織中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用TB Green ? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR。引物由華大基因合成。小鼠β-actin引物序列為F:5’-AGCCATGTACGTA GCCATCC-3’，R:5’-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3’；Ucp1引物序列為F:5’-ACTGCCACACCT CCAGTCATt-3’，R:5’-CTTTGCCTCACTCAGGA TTGG-3’。實(shí)時定量PCR的反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95℃變性5 s，40個循環(huán)；60℃退火30 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，基因差異表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計算:△△Ct＝(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.3.5 ELISA

將收集的全血室溫靜置片刻，4℃下以3000 r/min離心10 min，收集上層血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中AST、ALT和TNF-α的含量。

1.3.6 圖像采集與分析

使用OLYMPUS光學(xué)顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行取圖，使用Image J軟件對組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行光密度測定，使用GraphPad Prism 5.0軟件繪制所有統(tǒng)計圖表。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，兩變量間的相關(guān)性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性肝損傷2周和4周肝的病理變化

與對照組相比，CCl42周組肝可見明顯的細(xì)胞壞死、核溶解，肝細(xì)胞排列紊亂、肝竇擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1A、1B)；與CCl42周組相比，CCl44周組肝可見少量肝細(xì)胞壞死和炎性浸潤(圖1B、1C)。

2.2 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中ALT、AST的含量

與對照組相比，CCl42周組血清中ALT含量增加(圖2A，P＜0.01)，AST含量增加(圖2B，P＜0.01)；與CCl42周組相比，CCl44周組血清中ALT含量減少(圖2A，P＜0.05)，AST含量減少(圖2B，P＜0.05)。

2.3 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的重量

與對照組相比，CCl42周組棕色脂肪組織重量減少(圖3，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組棕色脂肪組織重量增加(圖3，P＜0.05)。

2.4 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的病理變化

與對照組相比，CCl42周組棕色脂肪組織脂滴增大，空泡增多(圖4A、4B)；與CCl42周組相比，CCl44周組棕色脂肪組織脂滴減小，但仍可見少量較大的脂滴(圖4B、4C)。

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組。圖1 小鼠急性肝損傷2周和4周肝的病理變化(HE染色)Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.Figure 1 Pathological changes in the liver of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks(HE staining)

注:與對照組相比，**P＜0.01；與CCl4 2周組相比，＃P＜0.05。圖2 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中ALT、AST的含量Note.Compared with the control group，**P＜0.01.Compared with the CCl4 2-week group，＃P＜0.05.Figure 2 Serum content of ALT and AST in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

注:與對照組相比，*P＜0.05；與CCl4 2周相比，＃P＜0.05。圖3 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的重量Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the CCl4 2-week group，＃P＜0.05.Figure 3 Weight of brown a dipose tissue in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

2.5 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織UCP1的表達(dá)

用免疫組化方法檢測棕色脂肪組織特異性蛋白UCP1的變化，與對照組相比，CCl42周組UCP1蛋白表達(dá)量減少(圖5A、5B、5D，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組UCP1蛋白表達(dá)量增加不明顯(圖5B、5C、5D，P＞0.05)。

2.6 小鼠急性肝損傷2周和4周小鼠棕色脂肪組織Ucp1 mRNA的水平

與對照組相比，CCl42周組Ucp1 mRNA表達(dá)量減少(圖6，P＜0.05)；與CCl42周組相比，CCl44周組Ucp1 mRNA表達(dá)量增加(圖6，P＜0.01)。

2.7 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中TNF-α的含量

用ELISA法檢測血清中TNF-α的含量，與對照組相比，CCl42周組血清中TNF-α含量增加(圖7，P＜0.001)；與CCl42周組相比，CCl44周組血清中TNF-α含量減少(圖7，P＜0.001)。

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組。圖4 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織的病理變化(HE染色)Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.Figure 4 Pathological changes in brown adipose tissue in mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks(HE staining)

注:A:對照組；B:CCl4 2周組；C:CCl4 4周組；D:光密度均值。與對照組相比，*P＜0.05。圖5 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織UCP1的免疫組化結(jié)果Note.A，Control group.B，CCl4 2-week group.C，CCl4 4-week group.D，Mean optical density value.Compared with the control group，*P＜0.05.Figure 5 Immunohistochemical results of UCP1 in brown adipose tissue of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

2.8 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量的相關(guān)性分析

使用Pearson法來檢驗(yàn)棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量之間的關(guān)系，CCl42周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNFα含量呈顯著負(fù)相關(guān)(表1，P＜0.01)；CCl44周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平與血清TNF-α含量呈顯著負(fù)相關(guān)(表2，P＜0.05)。

表1 CCl4 2周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA與血清TNF-α的相關(guān)性Table 1 Correlation between Ucp1 mRNA in brown adipose tissue and serum TNF-αin the CCl4 2-week group

注:與對照組相比，*P＜0.05；與CCl4 2周組相比，＃＃P＜0.01。圖6 小鼠急性肝損傷2周和4周棕色脂肪組織Ucp1 mRNA的水平Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the CCl4 2-week group，＃＃P＜0.01.Figure 6 Ucp1 mRNA level in brown adipose tissue of mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

注:與對照組相比，***P＜0.001；與CCl4 2周相比，＃＃＃P＜0.001。圖7 小鼠急性肝損傷2周和4周血清中TNF-α的含量Note.Compared with the control group，***P＜0.001.Compared with the CCl4 2-week group，＃＃＃P＜0.001.Figure 7 Serum content of TNF-αin mice with acute liver injury at 2 and 4 weeks

表2 CCl4 4周組棕色脂肪組織Ucp1 mRNA與血清TNF-α的相關(guān)性Table 2 Correlation between Ucp1 mRNA in brown adipose tissue and serum TNF-αin the CCl4 4-week group

3 討論

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)目前已成為一個全球性問題，它是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，其臨床表現(xiàn)包括中心性肥胖、糖耐量異常、高血壓、血脂代謝紊亂[9]。脂肪組織與代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]，眾所周知，內(nèi)臟白色脂肪積聚是引起代謝綜合征的關(guān)鍵因素[11-12]。而自從在成年人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕色脂肪組織以來，棕色脂肪組織由于其在能量代謝中的作用而備受關(guān)注[13]，與白色脂肪組織儲存能量不同，棕色脂肪組織通過UCP1產(chǎn)生熱量[14]。因此，棕色脂肪組織被認(rèn)為是治療肥胖癥和代謝綜合征的新潛在靶標(biāo)[4]。肝在脂質(zhì)代謝中起著重要作用[6-7]，然而目前肝對棕色脂肪組織功能的影響知之甚少，本研究通過用CCl4制備急性肝損傷模型，觀察棕色脂肪組織功能的變化。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們分離的棕色脂肪組織為肩胛間棕色脂肪組織，它被認(rèn)為是經(jīng)典的棕色脂肪庫[15-16]。CCl4是誘導(dǎo)急性肝損傷模型的經(jīng)典藥物[17]，它主要的靶器官是肝，不會對其它器官造成明顯的損害[18]，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們可以排除CCl4對棕色脂肪組織的直接影響。此小鼠模型表現(xiàn)為肝功能障礙，包括炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死[19]。此外，急性肝損傷還伴有肝酶的升高，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)主要分布于肝細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要分布于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)急性肝損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加時，ALT、AST就會大量釋放到血液中，因此血清中ALT、AST升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[20]?；诒菊n題組造模的經(jīng)驗(yàn)，選用25% CCl4制備急性肝損傷模型，在2周和4周動態(tài)觀察肝和棕色脂肪組織的變化。

本研究結(jié)果顯示在急性肝損傷2周時觀察到肝損傷較嚴(yán)重，血清中ALT、AST含量明顯增多，棕色脂肪組織重量減少，脂滴增大，4周時肝損傷程度減輕，血清ALT、AST含量減少，棕色脂肪組織重量增加，脂滴減??；提示小鼠肝功能障礙可降低棕色脂肪組織的活化能力，使機(jī)體產(chǎn)熱減少。我們進(jìn)一步檢測了棕色脂肪組織UCP1的表達(dá)，UCP1是棕色脂肪組織線粒體內(nèi)膜上的特異性蛋白，通過線粒體膜中的質(zhì)子泄漏來耗散電化學(xué)質(zhì)子梯度，從而導(dǎo)致氧化磷酸化的解偶聯(lián)，使能量以熱量的形式釋放[2]，結(jié)果顯示2周時UCP1蛋白表達(dá)減少，Ucp1 mRNA水平降低，4周時Ucp1 mRNA水平升高，表明肝功能障礙可導(dǎo)致棕色脂肪組織功能下降。此外，考慮到肝本身作為一個產(chǎn)熱器官，急性肝損傷時肝產(chǎn)熱功能也會受到影響，但本研究主要測定的是棕色脂肪組織UCP1的變化，UCP1是表達(dá)于棕色脂肪組織的特異性蛋白[2]，以此判斷急性肝損傷對棕色脂肪組織產(chǎn)熱能力的影響。

有研究表明腹腔注射重組TNF-α蛋白能抑制小鼠白色和棕色脂肪組織中的UCP1[21]。另外，Chen等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)急性肝損傷后肝枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KC)被激活，釋放促炎因子TNF-α，進(jìn)一步加重肝的損傷。因此，我們檢測了血清中TNFα的含量，結(jié)果顯示肝損傷2周時血清中TNF-α含量增加，4周時下降，提示棕色脂肪組織UCP1的表達(dá)與血清TNF-α含量的變化有關(guān)。為了進(jìn)一步表明它們之間的關(guān)系，通過Pearson法檢驗(yàn)棕色脂肪組織Ucp1 mRNA水平和血清TNF-α含量之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示2周和4周時棕色脂肪組織Ucp1 mRNA和血清TNF-α均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，提示在小鼠急性肝損傷2周時，激活的肝枯否細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α到血清中，抑制棕色脂肪組織UCP1的表達(dá)；而在4周時，肝恢復(fù)部分功能，血清中TNF-α水平下降，棕色脂肪組織Ucp1 mRNA表達(dá)增加。而UCP1蛋白表達(dá)增加不明顯，可能原因是基因水平的變化提前于蛋白水平的變化。

綜上所述，在小鼠急性肝損傷后，棕色脂肪組織重量減少、脂滴增大、特異性蛋白UCP1表達(dá)減少、活化能力降低，提示肝功能障礙可導(dǎo)致棕色脂肪組織功能下降，機(jī)體產(chǎn)熱減少，從而影響代謝穩(wěn)態(tài)，機(jī)制可能與TNF-α含量升高有關(guān)。