基于NF-κB/JNK信號通路研究他克莫司對脊髓損傷模型大鼠的調(diào)節(jié)作用

張七妹，柴 芳*，麥宜準(zhǔn)，郭仁芬，王 光

(1.三亞市人民醫(yī)院，海南 三亞 572000；2.海南醫(yī)學(xué)院，?？?570102)

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來脊髓損傷的發(fā)病率呈現(xiàn)高發(fā)趨勢，并具有高致殘、高致死的臨床特征。臨床將其分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷；原發(fā)性脊髓損傷則主要是由于瞬間外力或局部出血導(dǎo)致的不可逆神經(jīng)細(xì)胞直接受損。而繼發(fā)性脊髓損傷則是由于原發(fā)性脊髓損傷后因各種原因引起的持續(xù)性病理損傷，其中炎癥、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡等均參與了繼發(fā)性脊髓損傷過程[1-4]。脊髓組織發(fā)生損傷后，導(dǎo)致脊髓內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)信號通路受損，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元持續(xù)凋亡、壞死；且受損組織處星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、增生，最終形成膠質(zhì)瘢痕[5-6]。因此，神經(jīng)保護(hù)類藥物在脊髓損傷的臨床治療及恢復(fù)也已成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

他克莫司(Tacrolimus)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。大量文獻(xiàn)表明，他克莫司還具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，其受體蛋白FKBPP(FK506 binding protein，F(xiàn)KBPP)在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布。他克莫司能夠與FKBPP受體蛋白結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)神經(jīng)再生作用。脊髓受損后，其脊髓組織中的神經(jīng)元會(huì)加速發(fā)生凋亡；因此，阻斷和延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡對于脊髓損傷后的恢復(fù)具有重要意義[7-8]。

因此，本研究旨在通過觀察給予他克莫司后脊髓損傷大鼠的恢復(fù)狀況，并探究其對NF-κB/JNK通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體重為220～240 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2017-002]，實(shí)驗(yàn)在海南醫(yī)學(xué)院[SYXK(瓊)2017-0025]進(jìn)行，研究方案經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院委員會(huì)機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC 20170524005)。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

他克莫司購買自Astellas Ireland公司(日本)；TRIzol試劑RNA提取試劑盒(批號∶14105)購買自Invitrogen公司(卡爾斯巴德，美國)；PCR擴(kuò)增試劑盒(批號∶AK9906)購買自TaKaRa公司(日本)；NFκB(批號∶1416173)和JNK(批號∶J4750)相關(guān)抗體均購買自Sigma公司(美國)；IL-4(批號∶H005)和TGF-β(批號∶H034)試劑盒購買自南京建成生物科技有限公司(中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SCI大鼠模型的建立

大鼠在適應(yīng)兩周后，將所有實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為三組(n＝15):假手術(shù)組(Sham)，模型組(SCI)，他克莫司給藥組(SCI+0.3 g/kg)。采用Allen’s法建立T10脊髓損傷動(dòng)物模型[9-10]。首先將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后，用10 g的鐵錘由4 cm，打擊強(qiáng)度為4.0 cm×10 g，損傷直徑約為3.0 mm。打擊后，可見大鼠雙后肢及尾部均可發(fā)生不同程度抽搐，提示脊髓損傷模型制備成功。假手術(shù)組則給予相同手術(shù)處理，但是不進(jìn)行脊髓損傷。術(shù)后若大鼠無異常情況，則縫合傷口；并每天腹腔注射給予實(shí)驗(yàn)大鼠青霉素8×104U，連續(xù)3 d以預(yù)防術(shù)后感染。造模后每天給予實(shí)驗(yàn)大鼠一次他克莫司0.3 mg/kg，連續(xù)給21 d。

1.3.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的BBB評分

按照Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分方法對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行測試[9-10]。分別在第0、1、7、14、21天進(jìn)行測試。BBB評分將大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能分為0～21分，共有22個(gè)等級。0分表明后肢無運(yùn)動(dòng)能力，21分表明后肢運(yùn)動(dòng)功能完全正常。

1.3.3 組織及形態(tài)學(xué)觀察

采用HE染色對神經(jīng)元形態(tài)的變化進(jìn)行觀察。手術(shù)21 d后將大鼠麻醉，采用4%多聚甲醛對大鼠進(jìn)行灌注；切取包括手術(shù)區(qū)域在內(nèi)的脊髓組織，并在4%的多聚甲醛中浸泡24 h。然后進(jìn)行脫水、包埋、切片，厚度約為5μm。進(jìn)行HE染色，封片后，在顯微鏡下觀察脊髓組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 RT-PCR分析脊髓組織中IL-4和TGF-β mRNA的表達(dá)水平

將收集的脊髓組織在液氮中進(jìn)行勻漿，并加入1 mL裂解液，采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，并測定相應(yīng)RNA的濃度。將提取的總RNA(2μL)加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合(共10μL)以合成cDNA。然后按照試劑盒說明書的具體指示測定IL-4和TGF-βmRNA的表達(dá)。

1.3.5 脊髓損傷后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

行為學(xué)時(shí)間結(jié)束后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉后，將各組大鼠處死后，收集以損傷取為中心的長約1 cm的脊髓，以冰冷的生理鹽水沖洗血液后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。各指標(biāo)均采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 Western blot分析

將收集的脊髓組織在液氮中進(jìn)行勻漿，加入一定量的蛋白裂解液，置于冰上，以200 r/min的速度搖床晃動(dòng)30 min；然后渦旋10 s，以12000 r/min離心15 min后取上清，并采用BCA法測定蛋白濃度。然后加入相應(yīng)體積的loading buffer，沸水浴中變性10 min。分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%的胎牛血清(BSA)封閉2 h后加入一抗，平緩搖動(dòng)于雜交袋，4℃過夜；TBST洗滌3次后加入熒光二抗，平緩搖動(dòng)于雜交袋內(nèi)2 h；棄去液體，TBST洗滌3次。凝膠成像系統(tǒng)成像，采用圖像分析軟件系統(tǒng)分析目的蛋白的相對灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組件分析；BBB評分則采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況

術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)大鼠均經(jīng)過BBB評分測試，所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前的BBB評分均為21分，表明實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)能力均正常，無任何運(yùn)動(dòng)障礙。其術(shù)后的BBB評分結(jié)果如表1所示，造模1 d后，假手術(shù)組與模型組相比BBB評分出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，表明脊髓損傷模型建立成功；當(dāng)連續(xù)給予他克莫司3 d后，其脊髓功能逐漸恢復(fù)，各組差異逐漸加大；當(dāng)連續(xù)給藥21 d后，其BBB評分明顯升高(P＜0.05)，表明他克莫司對于大鼠脊髓損傷均有一定的改善作用。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的脊髓組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，纖維走向平行一致，與周圍組織結(jié)構(gòu)清晰，且無出血現(xiàn)象和瘢痕組織生成。而模型組大鼠脊髓組織內(nèi)部出血，結(jié)構(gòu)排列紊亂，且組織纖維錯(cuò)亂，脊髓空洞形成，脊髓組織出現(xiàn)明顯受損。當(dāng)給予他克莫司后，其脊髓組織損傷明顯減小，脊髓神經(jīng)元明顯增加，神經(jīng)纖維排列整體，脊髓灰質(zhì)白質(zhì)界線較為清晰，空洞明顯減少，見圖1。

表1 術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)大鼠在造模后不同時(shí)間的BBB評分結(jié)果(±s)Table 1 BBB scores of rats in each group on different days after operation

表1 術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)大鼠在造模后不同時(shí)間的BBB評分結(jié)果(±s)Table 1 BBB scores of rats in each group on different days after operation

注:與Sham組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與SCI組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with Sham group，*P＜0.05，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃P＜0.05.

組別Groups第1天1 d第3天3 d第7天7 d第14天14 d第21天21 d假手術(shù)組Sham 18.63±2.31 19.73±1.15 19.48±1.24 20.03±1.06 19.78±0.96模型組SCI 2.43±1.97** 3.72±1.32** 7.58±1.65** 9.64±1.42* 10.36±1.05*給藥組SCI+0.3 mg/kg 2.25±1.45 5.21±1.97 9.84±1.26 13.27±0.79 18.31±0.84＃

2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達(dá)水平

術(shù)后21 d后，采用RT-PCR對各組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織中的IL-4 mRNA和TGF-βmRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA表達(dá)量均顯著性升高(P＜0.05)；當(dāng)連續(xù)給予他克莫司(0.3 mg/kg)后，其IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的蛋白表達(dá)量顯著性降低(P＜0.05)，表明他克莫司能夠顯著性抑制IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達(dá)，見圖2。

2.4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組組中CAT(圖3A)、SOD(圖3B)、GSH-Px(圖3C)活性均較與假手術(shù)組顯著性降低(P＜0.05)，MDA(圖3D)含量顯著性升高(P＜0.05)，表明模型組大鼠機(jī)體發(fā)生氧化損傷，當(dāng)給予他克莫司后，機(jī)體中CAT、SOD、GSH-Px活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低(P＜0.05)，表明他克莫司對脊髓損傷導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)大鼠氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用，見圖3。

2.5 他克莫司對脊髓損傷大鼠脊髓組織中NFκB/JNK信號通路的調(diào)節(jié)作用

與假手術(shù)組相比，模型組中NF-κB p-p65/NFκB p-p65(圖4A、4B)和p-JNK/JNK(圖4A、4C)的表達(dá)量比值顯著性升高；當(dāng)給予他克莫司后，其NFκB p-p65/NF-κB p-p65和p-JNK/JNK表達(dá)量比值顯著性降低；這表明他克莫司對于NF-κB/JNK信號通路具有明顯的調(diào)節(jié)作用，見圖4。

3 討論

脊髓損傷在臨床診治過程中非常常見，但是其病理機(jī)制較為復(fù)雜。有研究表明脊髓損傷后誘發(fā)的神經(jīng)毒性反應(yīng)會(huì)加重神經(jīng)元的丟失，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。機(jī)體的過炎癥反應(yīng)對神經(jīng)元的丟失起著至關(guān)重要的作用[11-13]。正常情況下，脊髓受損后一定程度的炎癥反應(yīng)，能夠加速受損組織修復(fù)，對于機(jī)體組織有著一定的保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體處于過炎癥狀態(tài)時(shí)，則會(huì)加速神經(jīng)元丟失。因此，有效的抑制脊髓損傷機(jī)體組織的過炎癥反應(yīng)，對于神經(jīng)功能的保護(hù)及恢復(fù)起著重要作用。他克莫司作為一種免疫抑制類藥物，具有減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞及組織再生的功能，能夠作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。他克莫司必須與其受體蛋白相結(jié)合才能發(fā)揮作用，研究表明他克莫司的受體蛋白廣泛存在于免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子類藥物相比較，他克莫司口服后即可起效，且更加容易通過血腦屏障；因此，他克莫司在神經(jīng)保護(hù)相關(guān)領(lǐng)域研究中得到了廣泛的關(guān)注[14-15]。

注:與Sham組相比，**P＜0.01；與SCI組相比，＃＃P＜0.01。圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓組織中IL-4 mRNA和TGF-βmRNA的表達(dá)水平Note.Compared with Sham group，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃＃P＜0.01.Figure 2 The expression levels of IL-4 mRNA and TGF-βmRNA in spinal cord tissue of rats in each group

注:與Sham組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與SCI組相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。圖4 各組脊髓損傷大鼠脊髓組織中NF-κB p-p65、NF-κB p-p65、p-JNK和JNK的蛋白表達(dá)量變化Note.Compared with Sham group，*P＜0.05，**P＜0.01.Compared with SCI group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01.Figure 4 Changes of protein expressions of NF-κB p-p65，NF-κB p-p65，p-JNK and JNK in spinal cord tissues of rats with spinal cord injury in each group

脊髓組織由于富含各種脂質(zhì)類成分，因此對于氧化反應(yīng)較為敏感。在正常的生理狀態(tài)下，機(jī)體組織產(chǎn)生的超氧陰離子、過氧化氫等產(chǎn)物均可被SOD、CAT等抗氧化酶所清除，機(jī)體的氧化與抗氧化體系處于一種動(dòng)態(tài)平衡過程，因此不會(huì)對于脊髓組織產(chǎn)生病理性損傷。然而，當(dāng)機(jī)體受損后，機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制會(huì)使得機(jī)體處于過氧化狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷大鼠機(jī)體處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，而他克莫司對于這種氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷具有一定的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激損傷能夠誘發(fā)或加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)。有研究表明，機(jī)體組織受損后，會(huì)導(dǎo)致各種免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤在損傷處，并分泌各種炎癥因子和促炎因子，例如IL-4、TGF-β等，促進(jìn)機(jī)體組織的自我修復(fù)。而過度的IL-4、TGF-β分泌，則會(huì)導(dǎo)致硬膜外瘢痕的形成。而NF-κB信號通路的抑制，則能夠顯著性降低IL-4和TGF-β的表達(dá)。JNK信號通路則是參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路，對于神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和再生起著中重要作用[19-22]。因此，本研究測定了IL-4和TGF-β的表達(dá)水平，以及NFκB/JNK信號通路相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示機(jī)體處于過炎癥反應(yīng)，而他克莫司對于脊髓損傷誘發(fā)的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。然而，他克莫司在臨床應(yīng)用中部分會(huì)發(fā)生劑量依賴性的輕、中度神經(jīng)毒性作用，并且其神經(jīng)毒性的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。這極大的限制了他克莫司的臨床使用。因此，他克莫司的相關(guān)衍生物的研制就顯得極為重要。

綜上所述，本研究結(jié)果表明他克莫司對大鼠脊髓損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-KN/JNK信號通路，降低脊髓損傷組織的炎癥因子釋放，進(jìn)而減輕機(jī)體炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但是由于本實(shí)驗(yàn)樣本及其數(shù)量的局限性，其在臨床的推廣及應(yīng)用仍需要進(jìn)一步的研究。