黃芪甲苷對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及超微結(jié)構(gòu)的影響

靳曉飛，張彐寧，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI)歸屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，“氣虛血瘀、經(jīng)脈不通”是其主要病機(jī)，使用補(bǔ)氣活血藥可達(dá)到良好的治療效果[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制至今仍未完全闡明，而再灌注期間大量炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，被認(rèn)為是腦缺血后再灌注引起損傷的重要機(jī)制之一[2-3]。中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥，被譽(yù)為補(bǔ)氣藥中的“耆長”。大量文獻(xiàn)記載和臨床研究證實(shí)，黃芪不僅具有補(bǔ)氣的作用，還兼具活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功，在防治腦缺血再灌注損傷方面效果顯著[4-5]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AST)是黃芪的重要活性單體成分，是黃芪補(bǔ)氣行血、通經(jīng)活絡(luò)的物質(zhì)基礎(chǔ)，常作為檢測黃芪質(zhì)量優(yōu)劣的參考指標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可有效減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]，但是其具體作用機(jī)制以及對腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，尚不明確。本研究重點(diǎn)探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及超微結(jié)構(gòu)的影響，為黃芪甲苷拮抗腦缺血再灌注損傷提供新的研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠(雄性，健康清潔級，40只，體重260～280 g，鼠齡7～8周)，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司[SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)在河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(冀)2017-005]。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度為22℃～25℃，相對濕度為50%～60%，進(jìn)食自由。動物實(shí)驗(yàn)通過河北中醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(DWLL2018032)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪甲苷購買于上海士峰生物科技公司，規(guī)格∶每瓶20 mg，純度≥98%，生產(chǎn)批號∶15082136；尼莫地平注射液、TTC染液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、戊巴比妥鈉、大鼠模型制作線栓(型號∶2838A3)、甲苯胺藍(lán)水溶液均購買于北京索萊寶生物公司；其他試劑均是國產(chǎn)分析純。

腦切片模具(型號∶BS-300C)購置于北京西濃科技公司；組織包埋機(jī)(型號∶EG11508)、全自動切片機(jī)(型號∶RM2255)、倒置光學(xué)顯微鏡(型號∶DMI3000B)均購置于Leica公司；透射電子顯微鏡(型號∶H-7650)購置于HITACHI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥和模型建立

應(yīng)用隨機(jī)單位組設(shè)計分組法，將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組∶假手術(shù)組(Sham)、模型組(腦缺血再灌注損傷組，Model)、黃芪甲苷組(AST)和尼莫地平組(陽性藥物組，NIM)。采用大腦中動脈閉塞(MCAO)法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型[7]:大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，手術(shù)前4 h禁止給水、12 h禁止喂食；用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定在小動物手術(shù)臺上，小心備皮，酒精棉球消毒；從大鼠頸部正中切開一小口，逐層分離組織，找到左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，將頸外動脈結(jié)扎、阻斷，選用特定線栓通過頸外動脈殘端插入，后經(jīng)頸內(nèi)動脈抵達(dá)大鼠大腦中動脈，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈缺血閉塞；線栓阻塞大腦中動脈(缺血)2 h后拔出，再灌注24 h；選取造模成功大鼠，處死，取材，檢測相關(guān)指標(biāo)。其中，黃芪甲苷組(給藥濃度為20 mg/kg)、尼莫地平組(給藥濃度為10 mg/kg)于造模前一周腹腔注射給藥，每24 h追加給藥一次；假手術(shù)組僅分離暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不做線栓插入處理；假手術(shù)組和模型組均給予等量生理鹽水腹腔注射處理。需說明的是，動物造模有死亡現(xiàn)象，本研究僅將造模成功的大鼠列為實(shí)驗(yàn)對象，造模成功率在80%以上。

1.3.2 Zea Longa評分法檢測大鼠神經(jīng)功能

評分標(biāo)準(zhǔn)∶0分，沒有任何神經(jīng)功能缺損，大鼠正常；1分，對側(cè)前爪不能伸展完全；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行走；3分，向?qū)?cè)行走傾倒；4分，意識不清，不能站立行走。每組大鼠于再灌注24 h后立即做Zea Longa評分，得1、2或3分者視為造模成功。

1.3.3 TTC染色檢測腦梗死體積

大鼠做完神經(jīng)功能評分后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦。將完好的腦組織放在-20℃冰箱，速凍15 min，應(yīng)用腦切片模具對大腦行冠狀位切片(2 mm)。將腦切片置于2% TTC染液，放在切片盒，37℃避光反應(yīng)30 min。其間，每隔10 min用鑷子翻動腦切片，保證染色均勻。隨后，吸取TTC染液，4%多聚甲醛固定腦切片1 h，拍照。正常腦組織呈現(xiàn)紅色，腦梗死組織呈現(xiàn)白色。用Image Pro Plus 6.0軟件對拍照結(jié)果進(jìn)行分析，計算腦梗死體積。

1.3.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量

各組取同質(zhì)量(100 mg)缺血區(qū)腦皮質(zhì)組織，生理鹽水清洗3遍，濾紙吸干組織表面水分，天平稱重，用預(yù)冷生理鹽水將組織制成組織勻漿(腦組織g∶生理鹽水mL＝1∶9)，低溫高速離心10 min，取上清液。參照ELISA試劑盒說明書步驟操作，酶標(biāo)儀檢測各孔樣本OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣本OD值，計算TNF-α、IL-6、IL-1β的相應(yīng)含量。

1.3.5 尼氏染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

制缺血區(qū)腦皮質(zhì)石蠟切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，100%、95%、90%、80%、70%、50%梯度酒精脫水，1%甲苯胺藍(lán)溶液染色，置于60℃恒溫箱反應(yīng)40 min，蒸餾水沖洗3次(每次3 min)，95%酒精分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，倒置顯微鏡400倍鏡下觀察、拍照。正常神經(jīng)元中尼氏體數(shù)量豐富；當(dāng)神經(jīng)元受損時，尼氏體可減少、解體或消失。

1.3.6 透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

制作缺血區(qū)腦皮質(zhì)1 mm3組織塊，PBS浸洗組織3遍，4%戊二醛固定組織2 h，PBS浸洗組織3遍，1%鋨酸固定組織2 h，50%、70%、80%、90%、100%梯度丙酮脫水，純包埋劑處理，37℃、60℃恒溫箱聚合，超薄切片機(jī)切片(厚度50 nm左右)，醋酸鈾、酸鉛雙染，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為0，無神經(jīng)功能缺損癥狀；與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分明顯升高(P＜0.05)，大鼠出現(xiàn)對側(cè)前爪不能伸展完全、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行走、向?qū)?cè)行走傾倒等不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組神經(jīng)功能評分有所降低(P＜0.05)，神經(jīng)功能缺損有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)Table 1 Effects of astragaloside IV on nerve function score in rats

表1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)Table 1 Effects of astragaloside IV on nerve function score in rats

注:與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.

組別Groups劑量(mg/kg)Doses評分Scores假手術(shù)組Sham — 0模型組Model — 2.50±0.55*黃芪甲苷組AST 20 1.67±0.82＃尼莫地平組NIM 10 1.83±0.75＃

2.2 黃芪甲苷對大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組未見腦梗死病灶；與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積明顯增加(P＜0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組腦梗死體積均減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。圖1 黃芪甲苷對大鼠腦梗死體積的影響Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Figure 1 Effects of astragaloside IV on the volume of cerebral infarction in rats

2.3 黃芪甲苷對炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均升高(P＜0.05)，提示炎性損傷顯著；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組TNFα、IL-6、IL-1β含量均下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2 黃芪甲苷對TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響(±s，pg/mL)Table 2 Effects of astragaloside IV on the contents of TNF-α、IL-6 and IL-1β

表2 黃芪甲苷對TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響(±s，pg/mL)Table 2 Effects of astragaloside IV on the contents of TNF-α、IL-6 and IL-1β

注:與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.

組別Groups 劑量(mg/kg)Doses TNF-α IL-6 IL-1β假手術(shù)組Sham — 30.46±4.78 12.62±2.88 6.11±0.89模型組Model — 45.09±6.34* 23.42±4.01* 10.60±1.73*黃芪甲苷組AST 20 36.47±6.02＃ 16.47±3.86＃ 7.25±1.44＃尼莫地平組NIM 10 33.92±5.57＃ 14.94±3.28＃ 6.84±1.06＃

2.4 黃芪甲苷對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞和尼氏體數(shù)量豐富，細(xì)胞規(guī)整、排列整齊，未見壞死細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變形，細(xì)胞排列混亂，尼氏體數(shù)量明顯減少(P＜0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組細(xì)胞狀態(tài)得到改善，尼氏體數(shù)量增多(P＜0.05)，細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞形狀趨于規(guī)整(見圖2)。

2.5 黃芪甲苷對神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響

假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰正常，細(xì)胞膜完好，細(xì)胞核規(guī)整，染色質(zhì)分布均勻；與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞核變形，核出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)分布不均勻，少量細(xì)胞可見細(xì)胞膜破損、線粒體腫脹且數(shù)量減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等細(xì)胞壞死表現(xiàn)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞核較為規(guī)整，核固縮減輕，染色質(zhì)分布較為均勻，線粒體腫脹減輕且數(shù)量增多，壞死細(xì)胞減少(見圖3)。

3 討論

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)與腫瘤、心臟病已并列成為導(dǎo)致人類死亡的三大疾病，嚴(yán)重影響著人類生活和健康，危害巨大[8]。腦血管疾病根據(jù)其病因可分為出血性腦血管病和缺血性腦血管病兩大類，其中缺血性腦血管病更為多見，其發(fā)病率和死亡率不斷攀升，危害巨大。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病治療和恢復(fù)過程中的一個重要病理過程，目前仍然是阻礙缺血性腦血管病臨床治療效果的一大難題。腦缺血再灌注損傷的產(chǎn)生機(jī)制涉及多方面因素，炎癥反應(yīng)在其中扮演著重要角色[2，9]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注可產(chǎn)生大量氧自由基，繼而激活炎性細(xì)胞，釋放大量炎癥因子，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等，其中TNF-α是大多數(shù)炎癥因子的啟動因子，TNF-α、IL-6的產(chǎn)生可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β，促使NOS生成增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)。與此同時，大量炎癥因子的釋放可導(dǎo)致更多的炎性細(xì)胞集聚和浸潤，形成一種相互作用、相互增強(qiáng)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起惡性循環(huán)，最終造成再灌注損傷[10]。

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。圖2 黃芪甲苷對神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響(尼氏染色)Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Figure 2 Effects of astragaloside IV on the morphological changes of nerve cells(Nissl staining)

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。圖3 黃芪甲苷對神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Figure 3 Effects of astragaloside IV on the ultrastructural changes of nerve cells

黃芪是一味臨床常用補(bǔ)氣要藥，收錄在《中華人民共和國藥典》，素有“補(bǔ)氣藥之耆長”、“補(bǔ)氣升陽之要藥”、“瘡家圣藥”等美譽(yù)[11]。大量醫(yī)籍記載，黃芪補(bǔ)氣兼活血，具有良好的活血化瘀的作用?！睹t(yī)別錄》首載其能“逐五臟間惡血”，《藥類法象》指出黃芪善冶“血脈不行”，《本草綱目》言其“生血活血”；《金匱要略》中黃芪桂枝五物湯以黃芪為君藥，治療血痹、中風(fēng)后遺癥，取得良好效果；《醫(yī)林改錯》中補(bǔ)陽還五湯重用黃芪，意在補(bǔ)益元?dú)?，使氣盛則血行，瘀去而絡(luò)脈通暢，廣泛用于治療缺血性中風(fēng)及腦缺血后遺癥[4，12]。黃芪的主要化學(xué)成分包括黃芪皂苷類、黃芪黃酮類和黃芪多糖類，其中黃芪甲苷是黃芪皂苷類的活性單體成分，被認(rèn)為是黃芪補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)控自噬等生物活性[15-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可有效降低腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能障礙，抑制缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，但是其具體作用機(jī)制以及對神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，尚不明確，亟待探究。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，在動物水平，從炎癥反應(yīng)角度，探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及超微結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，腦梗死體積明顯增加，神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病變，細(xì)胞核變形、固縮，染色質(zhì)分布不均勻，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均上升；當(dāng)分別給予黃芪甲苷和尼莫地平處理后，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，腦梗死體積減少，神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)得到改善，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均下降，表明黃芪甲苷減輕大鼠腦缺血再灌注損傷、改善神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，與抑制炎癥反應(yīng)、降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)密切相關(guān)。該研究結(jié)果為黃芪甲苷抑制腦缺血再灌注損傷的抗炎作用機(jī)制提供了一定理論依據(jù)。然而，黃芪甲苷發(fā)揮抗炎作用的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何?其抗炎作用與黃芪甲苷其他生物活性是否存在相互聯(lián)系?尚需進(jìn)一步探究，這也將是我們課題組下一步研究的重點(diǎn)。