芒果苷減輕缺氧復(fù)氧所致人心肌細(xì)胞損傷

李 剛，余朝萍，龔厚文，劉天虎

（成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川成都611730）

冠心病和心肌梗死是嚴(yán)重威脅人類生命的主要疾病之一，心肌梗死后血運(yùn)重建過程中可能造成心肌缺血再灌注損傷，加重心肌細(xì)胞缺血和凋亡［1］。心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不可再生，抑制心肌細(xì)胞凋亡將會(huì)對(duì)缺血再灌注損傷的心肌起著非常重要的保護(hù)作用。芒果苷（mangineferin，MAG）是一種天然的多酚類物質(zhì)，廣泛存在于許多藥材如百合科植物知母以及芒果的果實(shí)、皮和樹葉中。大量研究表明，芒果苷在抗糖尿病、抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等方面具有廣泛的藥理作用［2］。已有研究表明芒果苷對(duì)柔紅霉素所致的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用［3］。然而，芒果苷對(duì)受損心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及作用機(jī)制仍不明確。據(jù)此，本研究擬通過建立人心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，深入探討芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。

材料和方法

1 材料

人心肌AC16細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。抗Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和超氧化物岐化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）抗體，鼠抗兔 HRP-IgG，兔抗鼠HRP-IgG（Cell Signaling Technology）；抗核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）抗體（Santa Cruz）；抗Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1，Keap-1）抗體（Proteintech）；活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）熒光探針DCFH-DA（Solarbio）；CCK-8試劑盒（Sigma）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和蛋白核質(zhì)分離試劑盒（NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents）均購(gòu)自 Thermo Fisher；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（Vazyme）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及H/R模型的建立 將AC16細(xì)胞分為：（1）正常（normal）組；（2）H/R 組；（3）H/R+低劑量（50 μmol/L）芒果苷（MAG-L）組；（4）H/R+中劑量（100 μmol/L）芒果苷（MAG-M）組；（5）H/R+高劑量（200 μmol/L）芒果苷（MAG-H）組。將AC16細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)后接種至不同培養(yǎng)板中，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換成用混合氣（95%CO2+5%N2）預(yù)飽和過的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS），同時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至缺氧小室中，持續(xù)通入混合氣（95%CO2+5%N2）10 min，夾緊進(jìn)氣管和出氣管，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。缺氧完畢后，換成完全培養(yǎng)液（高糖DMEM+10%FBS），置于CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取處理后的AC16細(xì)胞，以5×107/L接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種12 h細(xì)胞貼壁后，按各組要求繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后用CCK-8法測(cè)定各孔吸光度（A），設(shè)定低氧組細(xì)胞活力為1，其余各組相對(duì)細(xì)胞活力等于各組A與對(duì)照組A比值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照Annexin VFITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書中對(duì)貼壁細(xì)胞的處理及檢測(cè)方法對(duì)AC16細(xì)胞的凋亡進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4 RT-qPCR法測(cè)定RNA的表達(dá)水平 用OMEGA總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，按操作說明書進(jìn)行。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。

2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、SOD2、Nrf-2和Keap-1的蛋白表達(dá)水平 裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，1∶1 000稀釋的抗Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、SOD2、Nrf-2和Keap-1抗體4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜3次，每次10 min，用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的II抗（1∶3 000稀釋）室溫孵育1 h后，TBST振搖洗膜3次，每次10 min。ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后機(jī)器掃描存盤，以ImageJ軟件進(jìn)行條帶分析。

2.6 ROS的檢測(cè) 按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFHDA中，細(xì)胞密度為1×109～2×1010/L，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。

表1 用于RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力下降，凋亡率增加（P＜0.05)；各劑量芒果苷均可顯著增強(qiáng)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力，抑制其凋亡（P＜0.05）；中、高劑量組效應(yīng)明顯強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無(wú)明顯差異，見表2及圖1。

2 芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞miR-432-3p表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，缺氧復(fù)氧對(duì)AC16細(xì)胞miR-432-3p表達(dá)無(wú)明顯影響；各劑量芒果苷均可顯著升高缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞miR-432-3p表達(dá)（P＜0.05）；中、高劑量組效應(yīng)明顯強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無(wú)明顯差異，見表3。

3 芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

相對(duì)于正常組，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，SOD2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞ROS水平，升高SOD2的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05）；中、高劑量組效應(yīng)明顯強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無(wú)明顯差異，見表3及圖2。

表2 各組細(xì)胞活力和凋亡細(xì)胞百分比的比較Table 2.The comparison results of cell viability and percentage of apoptotic cells in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 1.The detection results of apoptosis by flow cytometry.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表3 各組細(xì)胞miR-432-3p和SOD2的相對(duì)表達(dá)量及ROS水平Table 3.The relative expression of miR-432-3p and SOD2 and the level of ROS in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 2.The detection results of SOD2 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖2 Western blot檢測(cè)SOD2蛋白表達(dá)

4 芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧AC16細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表達(dá)的影響

相對(duì)于正常組，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后，AC16細(xì)胞Bax、caspase-3和caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低AC16細(xì)胞Bax、caspase-3和caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)，升高Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05）；中、高劑量組效應(yīng)明顯強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3及表4、5。

Figure 3.Detection results of Bax，Bcl-2，caspase-3 and caspase-9 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖3 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)

表4 各組凋亡相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較Table 4.Comparison of relative mRNA expression levels of apoptosis-related molecules in each group（Mean±SD.n=5）

5 芒果苷抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)Keap-1和Nrf-2表達(dá)的影響

缺氧復(fù)氧AC16細(xì)胞Keap-1的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，Nrf-2的核轉(zhuǎn)位明顯增多（P＜0.05）；各劑量芒果苷均可顯著降低缺氧復(fù)氧AC16細(xì)胞Keap-1的mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)Nrf-2核轉(zhuǎn)位（P＜0.05）；中、高劑量組的效應(yīng)明顯強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組之間無(wú)顯著差異，見表6及圖4。

表5 各組凋亡相關(guān)分子蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較Table 5.Comparison of relative protein expression levels of apoptosis-related molecules in each group（Mean±SD.n=5）

表6 各組Nrf-2和Keap-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Table 6.Comparison of relative mRNA and protein expression levels of Nrf-2 and Keap-1 in each group（Mean±SD.n=5）

Figure 4.Detection results of Nrf-2 and Keap-1 protein expression by Western blot.A：normal group；B：H/R group；C：H/R+MAG-L group；D：H/R+MAG-M group；E：H/R+MAG-H group.圖4 Western blot檢測(cè)Nrf-2和Keap-1蛋白表達(dá)

討 論

冠心病、心肌梗死缺血性心臟病發(fā)病率近年來逐漸上升，成為了威脅人類健康的主要疾病之一。利用冠脈擴(kuò)張等方法恢復(fù)缺血心肌細(xì)胞供血的過程中會(huì)導(dǎo)致缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［4］。心肌細(xì)胞I/R損傷涉及很多細(xì)胞分子機(jī)制，包括線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等[5]。其中，氧化應(yīng)激反應(yīng)在心肌細(xì)胞I/R損傷中發(fā)揮重要作用，ROS的產(chǎn)生會(huì)抑制SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶活性和表達(dá)，并且可以修飾細(xì)胞內(nèi)生物分子，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性等變化，給細(xì)胞造成一系列不可逆損傷[6]。研究表明，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)中ROS的產(chǎn)生可進(jìn)一步抑制心肌細(xì)胞I/R損傷[7]。因此，如何增強(qiáng)機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激損傷的抵抗力對(duì)于防治心肌細(xì)胞I/R損傷至關(guān)重要。

心肌細(xì)胞I/R損傷引發(fā)的氧化應(yīng)激、線粒體結(jié)構(gòu)功能變化會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死。參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的途徑主要有3個(gè)：（1）腫瘤壞死因子受體家族介導(dǎo)的死亡受體途徑[8]；（2）促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2調(diào)控的線粒體凋亡途徑[9]；（3）受Bcl-2調(diào)控，caspase-3、8、9參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明缺氧復(fù)氧條件導(dǎo)致心肌細(xì)胞促凋亡蛋白Bax上升，抗凋亡蛋白Bcl-2下降，caspase-3和caspase-9表達(dá)水平均上升，表明細(xì)胞凋亡途徑激活。

芒果苷又名芒果素，是一種四羥基吡酮的碳苷，屬雙苯吡酮類化合物。芒果苷具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用。既往研究顯示芒果苷對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡[11]和柔紅霉素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用。體外研究表明芒果苷對(duì)A549人類肺癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用[12]。體外和體內(nèi)模型試驗(yàn)證據(jù)表明芒果苷作為一種潛在的生物活性劑，可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制促炎因子的表達(dá)和ROS的生成[13]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芒果苷能顯著抑制缺氧復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，提高細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷的防御能力。

Keap-1/Nrf-2信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控SOD、CAT等抗氧化酶的表達(dá)和維持氧化/抗氧化平衡的重要通路[14]。Nrf-2屬于CNC調(diào)節(jié)蛋白家族，廣泛存在于機(jī)體各器官，是細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的主控調(diào)節(jié)因子。正常情況下，Nrf-2主要與其抑制劑Keap-1結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到ROS或其他親核劑刺激后，Nrf-2與Keap-1解偶聯(lián)，Nrf-2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因表達(dá)，調(diào)控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[15]。最近研究表明，miR-432-3p可直接靶向Keap-1，參與Keap-1/Nrf-2信號(hào)通路的調(diào)控[16]。本研究發(fā)現(xiàn)AC16細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)處理后，Keap-1表達(dá)無(wú)明顯變化，但Nrf-2核轉(zhuǎn)位明顯增多，表明缺氧復(fù)氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS生成增多促進(jìn)了Nrf-2的核轉(zhuǎn)位；本研究還發(fā)現(xiàn)芒果苷可以升高缺氧復(fù)氧AC16細(xì)胞的miR-432-3p表達(dá)，降低Keap-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Nrf-2的核轉(zhuǎn)位。

綜上所述，芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能與提高心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。Keap-1/Nrf-2信號(hào)通路是細(xì)胞抗氧化機(jī)制的重要途徑，芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能與其促進(jìn)miR-432-3p表達(dá)，上調(diào)Nrf-2抗氧化應(yīng)激效應(yīng)進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究深入揭示了芒果苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制，為防治缺血再灌注心肌損傷提供了新的思路及藥物靶標(biāo)。