免疫組化陽性對照組織的選擇

李真真，馬鈺

陜西省人民醫(yī)院病理科，陜西 西安 710068

免疫組化技術(shù)在病理診斷中的作用十分重要，免疫染色結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性依賴于免疫組化對照的設(shè)置[1-2]。無論是手工染色還是全自動免疫組化染色儀染色，任何不當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E均會影響染色結(jié)果，從而影響病理診斷，因此免疫組化染色中設(shè)立陽性對照至關(guān)重要[3]。根據(jù)對照結(jié)果可以判斷免疫組化操作步驟是否正確、使用試劑是否可靠，從而確保技術(shù)最佳化和結(jié)果的有效性[2]。目前，NORDIQC 已對100 種病理科常用一抗進行了室間質(zhì)控，并對其中87 種常用一抗提出了推薦對照組織。本文選取其中部分抗體，分別用各種不同的組織做為對照，觀察其抗原表達情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取陜西省人民醫(yī)院送檢標(biāo)本，其中包含腫瘤旁正常的扁桃體、闌尾、肝臟、腎臟、乳腺、結(jié)腸六種組織。這些組織經(jīng)過10%中性緩沖福爾馬林固定6～12 h 后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸泡后包埋制作成陽性對照組織蠟塊。將陽性對照塊根據(jù)組織類型進行分類，并進行常規(guī)切片，厚度為4 μm，將切好的對照片分類儲存。

1.2 試劑 一抗試劑中CD3、CD20、Ki-67購自羅氏診斷公司，其余一抗試劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，二抗及顯色系統(tǒng)均購自羅氏診斷公司。

1.3 對照組織的選擇 選取的組織經(jīng)過連續(xù)切片后最后一張進行HE 染色觀察,看是否含有合適相應(yīng)抗原表達的區(qū)域，以保證各組織包埋面含有相應(yīng)的組織成分。

1.4 對照蠟塊的使用 將扁桃體、闌尾、肝臟、腎臟、乳腺、結(jié)腸組織分成A、B、C、D、E、F六組進行常規(guī)切片后與待測組織裱于同一張黏附載玻片上，83℃烤片20 min，分別進行40種不同抗體的免疫組化染色。

1.5 免疫組化染色 在羅氏BenchMark XT 全自動免疫組化染色機上設(shè)置40 種不同抗體的染色程序，將烤好的切片貼上標(biāo)簽，放于染色機內(nèi)的獨立溫控板上進行免疫組化染色，手動滴加一抗，其他步驟均由機器自動完成。染色結(jié)束后，取出切片，將染好的切片進行梯度酒精脫水、樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 A 組 扁桃體組織中CK、HCK、E-cadherin、P120、CK5/6、EMA、CK7、CK8/18、CK19、P63 在上皮細(xì)胞呈現(xiàn)陽性，Calponin、SMA、Caldesmon、Desmin、Vim 在血管內(nèi)皮呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，ER 在鱗狀上皮細(xì)胞和分散的生發(fā)中心巨噬細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞核陽性，Ki-67、P16 在上皮細(xì)胞及生發(fā)中心均呈現(xiàn)部分細(xì)胞陽性，CD20、CD21、CD10、CD79α在淋巴濾泡生發(fā)中心呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性(圖1A)，LCA 在所有的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞均呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD3、CD7 在副皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD34 在血管內(nèi)皮呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)陽性，D2-40 在淋巴管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)陽性，CD38 在漿細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD138 在漿細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞中均呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，S-100 在生發(fā)中心的濾泡樹突細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽性。

2.2 B 組 闌尾組織中E-cadherin、P120、P504s、CK、CK8/18、CDX2、Villin、CK19、CK20 在腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性(圖1B)，CD38、CD138 在間質(zhì)漿細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，SMA、Calponin、Caldesmon、Desmin 在肌層肌纖維中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，CD7、CD3在副皮質(zhì)區(qū)部分淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD79α、CD10、CD20、CD21、LCA、ER 在淋巴濾泡生發(fā)中心呈現(xiàn)陽性，Syn、CgA、CD56、S-100 在肌層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性，Vim、CD34 在血管內(nèi)皮呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，D2-40在淋巴管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)陽性。

2.3 C 組 肝臟組織中P504s、HEPY、P16 在肝細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性(圖1C)，CD38 在匯管區(qū)的漿細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD138 在匯管區(qū)漿細(xì)胞和肝細(xì)胞中均呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，SMA 在間質(zhì)纖維中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，HCK、CD56 分別在膽管中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜陽性，CD7、CD79α、LCA 在間質(zhì)淋巴細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，E-cadherin、P120、CK 在肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中均呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，Vim、CD34、Caldesmon 在血管肌層細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，CK7、Villin、CK19 在小膽管中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，CD3、CD20 在匯管區(qū)淋巴細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，D2-40 在淋巴管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)陽性，CK8/18 在肝細(xì)胞和小膽管中均呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，Ki-67 在肝細(xì)胞、匯管區(qū)淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)點灶狀細(xì)胞核陽性，CD10 在肝細(xì)胞間的膽小管和小膽管中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜陽性，S-100 在匯管區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性。

2.4 D 組 腎臟組織中E-cadherin、P120、CD138、P504s、CK、CK7、CD3、CK8/18、Villin、CK19、PAX-8 均在腎小管中呈現(xiàn)陽性，Vim 在腎小球血管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，SMA、CD34、Caldesmon、Desmin、Calponin 在血管平滑肌中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，CD10 在腎小球和腎小管中均呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜陽性(圖1D)，Ki-67 在腎小球、腎小管和血管中呈現(xiàn)極個別細(xì)胞陽性表達。

2.5 E 組 乳腺組織中E-cadherin、P120、CK、CK7、CK8/18、CK19、ER、PR 在導(dǎo)管上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性(圖1E)，SMA、P63、CK5/6、CD10、Calponin、S-100在肌上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性，Vim、CD34 在間質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，P16 在肌上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中均呈現(xiàn)陽性，D2-40 在淋巴管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)陽性，CD138、HCK 在腺上皮和肌上皮細(xì)胞中均呈現(xiàn)陽性，SMA 在平滑肌細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，Ki-67 在部分腺上皮中呈現(xiàn)細(xì)胞核陽性。

2.6 F 組 結(jié)腸組織中E-cadherin、P120、CK、CK8/18、CDX2、Villin、CK19、HEPY 在腺上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性(圖1F)，CD138、CD38 在漿細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，SMA、Calpinin、Caldesmon、Desmin 在平滑肌細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，Syn、CgA、CD56、S-100 在肌層神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性，CD34、Vim 在血管內(nèi)皮中呈現(xiàn)陽性，CD79α、CD20、CD21 在淋巴濾泡生發(fā)中心呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，CD7、CD3、LCA 在副皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)細(xì)胞膜陽性，D2-40 在淋巴管內(nèi)皮中呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性，Ki-67 在生發(fā)中心和基底層細(xì)胞中呈現(xiàn)細(xì)胞核陽性。

圖1 不同抗體在不同對照組織的表達

3 討論

免疫組織化學(xué)技術(shù)在病理診斷中的作用極為重要，良好的染色結(jié)果能幫助病理醫(yī)生更準(zhǔn)確地進行病理診斷,不當(dāng)?shù)娜旧Y(jié)果可能會引起漏診或者誤診。染色過程中需要經(jīng)過多個步驟的操作,每一個步驟操作不當(dāng)都會影響染色結(jié)果進而影響病理診斷的準(zhǔn)確性[3]。因此，免疫組化染色的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化是實驗室的基本要求。手工染色容易受周圍溫度、濕度以及操作人員工作習(xí)慣影響，染色結(jié)果容易出現(xiàn)批次誤差，穩(wěn)定性較差。全自動免疫組化染色機染色著色均勻，背景干凈，定位準(zhǔn)確，無邊緣反應(yīng)，大大增加了染色結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，但如果染色機在運行過程中出現(xiàn)滑片或產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象，就會對染色結(jié)果造成一定的影響，容易造成誤診。因此，無論是手工染色還是機器染色，在染色過程中設(shè)立對照是進行質(zhì)控的重要措施之一，可以保證免疫染色過程中試劑的可靠性，操作的正確性，避免試劑失效，操作失當(dāng)或機器故障引起假陽性或假陰性的結(jié)果[4]。

目前各個醫(yī)院有不同的免疫組化對照選擇。香港伊利沙伯醫(yī)院陳國璋醫(yī)師運用多種組織制作香腸包埋塊陽性對照切片，效果較好，但對照組織面積大，消耗試劑多，制作過程也比較煩瑣[5]，且收集標(biāo)本所需時間周期較長，多種組織不易包埋于同一平面上，容易造成漏檢。另外一些單位選擇用組織芯片作為對照，組織芯片雖然抗體覆蓋面廣，且高通量的特點也使檢測的準(zhǔn)確性更高，同時更為節(jié)約組織，但組織芯片操作太過繁瑣，對制作過程要求高，包埋容易形成空泡，如果使用專業(yè)設(shè)備進行取材，又大大增加了工作成本[6]。相比較而言，單組織對照較易取材，面積較小，成本較低，更加節(jié)約試劑，適合基層機構(gòu)開展，其制作過程相對簡單，相同的組織量，單組織對照蠟塊可以切出更多的陽性對照片，相比較其他兩種對照方法，更加節(jié)約組織。

關(guān)于對照組織選擇的臨床研究，應(yīng)該遵循以下原則：(1)同一個病例在做多種免疫組化標(biāo)記時盡可能地選取同一種組織；若一種組織無法滿足需求時，可選擇兩到三種不同組織做為同一病例不同抗體的對照；(2)鱗狀上皮和淋巴系統(tǒng)標(biāo)記指標(biāo)可選擇扁桃體做為陽性對照；(3)平滑肌標(biāo)記指標(biāo)、腺上皮標(biāo)記指標(biāo)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)標(biāo)記指標(biāo)可選擇闌尾做為陽性對照；(4)正常肝臟、腎臟、乳腺、腸管組織可做為相應(yīng)組織惡性腫瘤的陽性對照。因為同種組織在染色過程中的內(nèi)環(huán)境相同，染色強度及著色部位也相同，更能準(zhǔn)確客觀地反映出組織中抗原與檢測抗體的結(jié)合情況，所以更適合做為同類組織的陽性對照。

有研究對100 種病理科常用抗體進行室間質(zhì)控，并給出了這些抗體推薦的陽性對照和陰性對照組織類型，其中推薦比較多的為扁桃體和闌尾組織[7-12]。通過對6 組不同組織染色結(jié)果進行分析后可以得出，扁桃體和闌尾可做為大部分抗體的陽性對照。具體來說，扁桃體可做為鱗狀上皮和淋巴系統(tǒng)以及血管和淋巴管相關(guān)抗體的陽性對照，闌尾可做為平滑肌、腺上皮、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)以及血管和淋巴管等相關(guān)抗體的陽性對照，其余四種組織則比較適合作為同組織類型腫瘤相關(guān)抗體的陽性對照。

綜上所述，在工作中選擇合適的單組織作為陽性對照，是提高免疫組化可靠性的值得推廣的對照方法。