口岸鼠體寄生螨類(lèi)分子鑒定

重慶國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（重慶海關(guān)口岸門(mén)診部）（重慶，401147）

螨類(lèi)種類(lèi)眾多，是影響農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生的重要節(jié)肢動(dòng)物。其中能引起人類(lèi)疾病的種類(lèi)有革螨，疥螨，恙螨，蠕形螨，粉螨和塵螨等。螨類(lèi)體型微小，生境復(fù)雜，都給螨類(lèi)研究帶來(lái)挑戰(zhàn)。在螨類(lèi)的分類(lèi)鑒定，生態(tài)學(xué)，病原生物傳播等領(lǐng)域存在較多空白[1-3]。

鼠體寄生螨類(lèi)是重要病媒生物，格氏血厲螨、廄真厲螨、阿爾及利亞螨和柏氏禽刺螨等均能自然感染森林腦炎、出血熱、Q熱、鼠疫和土拉弗氏菌等自然疫源性疾病，小盾纖恙螨和毒棘厲螨均可攜帶SFTSV，具有傳播SFTS的可能，革螨和恙螨是腎綜合征出血熱傳播媒介，恙螨還是恙蟲(chóng)病立克次體的傳播媒介[4-8]。

螨類(lèi)的種群鑒定以形態(tài)學(xué)鑒定為主。但是形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)本制作過(guò)程復(fù)雜，需要長(zhǎng)時(shí)間經(jīng)驗(yàn)積累。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在物種種群鑒定中的成功應(yīng)用，建立螨類(lèi)分子鑒定技術(shù)對(duì)準(zhǔn)確快速確定螨類(lèi)種群意義重大。賀麗敏等建立了基于COⅠ和ITS2的蒲螨分子鑒定方法，鑒定結(jié)果與形體學(xué)鑒定一致；張星星等利用COX1基因?qū)﹄u皮刺螨進(jìn)行鑒定，伍祎等建立了基于COⅠ的儲(chǔ)藏物螨類(lèi)分子鑒定技術(shù)，王少麗等建立了截形葉螨的分子鑒定方法。但是目前還沒(méi)有針對(duì)鼠體寄生螨類(lèi)的分子鑒定方法建立的研究[9-12]。

1 材料與方法

1.1 蜱螨類(lèi)標(biāo)本采集

采集重慶江北機(jī)場(chǎng)，寸灘港，涪陵港，萬(wàn)州港，湖北宜昌港和滿洲里等口岸鼠體寄生螨類(lèi)。螨類(lèi)采集方法參考《國(guó)檢字（2001）61 號(hào)》，質(zhì)檢衛(wèi)函（2016）16號(hào)文件規(guī)定方法實(shí)施。使用鼠籠法捕捉鼠類(lèi)進(jìn)行鼠體寄生螨類(lèi)搜集。將鼠類(lèi)用乙醚麻醉后搜集鼠體寄生螨類(lèi)，對(duì)螨類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)，用于制作形態(tài)學(xué)標(biāo)本投入70%酒精保存制作玻片標(biāo)本，用于分子鑒定的標(biāo)本置離心管于-80℃保存。

1.2 螨類(lèi)分子鑒定

1.2.1 引物篩選

查閱文獻(xiàn)和NCBI中蜱螨分子鑒定序列，設(shè)計(jì)鼠體寄生螨類(lèi)分子鑒定引物序列。包括用于擴(kuò)增COⅠ，COⅡ，Cytb，ITS2的通用引物如下：

表1

1.2.1 核酸提取

螨類(lèi)初步形態(tài)學(xué)鑒定后，選取形態(tài)一致的3-5只個(gè)體為一組，進(jìn)行核酸提取，同時(shí)對(duì)所選標(biāo)本進(jìn)行拍照。將樣本加入200ul PBS冷凍研磨，使用Qiagen DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取DNA，4℃保存，備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增程序及產(chǎn)物分析

PCR擴(kuò)增與測(cè)序PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：10×緩沖液 2.5μl，dNTP 1μl， 引物各 1μl，EX Taq 聚合酶0.2μl， 模板 DNA 1μl，ddH2O 18.3μl。 PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 45s，53℃退火 30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 2016-2018年分別在滿洲里和重慶口岸鼠類(lèi)監(jiān)測(cè)捕獲活鼠搜檢鼠體寄生螨類(lèi)，共檢獲各類(lèi)螨類(lèi)185只，各口岸鼠類(lèi)攜帶蜱類(lèi)情況如表2。鼠類(lèi)平均帶螨率為30.77%，鼠類(lèi)帶螨率最高的為滿洲里，為35.42%，最低為湖北宜昌口岸，為12.5%。但檢獲的螨大部分為若螨，部分螨形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

表2 各口岸鼠類(lèi)攜帶螨類(lèi)情況

2.2 螨類(lèi)分子鑒定

共提取8組螨類(lèi)核酸，分別擴(kuò)增ITS2，Cytb，COⅠ等基因部分片段。僅有COⅠ基因能獲得特異性片段，其中3組測(cè)序成功獲得特異性序列。將測(cè)序獲得的序列與GenBank中其他螨類(lèi)的COⅠ基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，形態(tài)學(xué)鑒定為毒厲蟎的螨類(lèi)與螨類(lèi)Laelaps muricola （鼠尾厲螨）COⅠ基因KU166775同源性較高，同源性為89.3%；形態(tài)學(xué)鑒定為柏氏禽刺螨的螨類(lèi)COⅠ基因與已知的柏氏禽刺螨Ornithonyssus bacoti COⅠ基因FM179677同源性100%。形態(tài)學(xué)未鑒定到種螨類(lèi)COⅠ基因分別與已知的螨類(lèi)COⅠ基因同源性均較低，與相似度最高的Pachylaelapidae sp的COⅠ基因同源性為77%。

圖1 螨類(lèi)COⅠ基因片段擴(kuò)增結(jié)果

圖2 螨類(lèi)形態(tài)及序列分析

3 討論

3.1 本研究對(duì)鼠體寄生螨進(jìn)行了分子鑒定研究，并成功獲得3種螨類(lèi)COⅠ基因序列，但目前數(shù)據(jù)庫(kù)中螨類(lèi)COⅠ基因序列數(shù)量較少，比對(duì)分析較困難。需要進(jìn)一步積累螨類(lèi)分子鑒定序列數(shù)據(jù)。

3.2 螨類(lèi)數(shù)量還需要進(jìn)一步擴(kuò)大。因時(shí)間關(guān)系采集螨主要集中在滿洲里和重慶口岸，種類(lèi)較少且單一，需進(jìn)一步擴(kuò)大采集口岸，使數(shù)據(jù)更具有代表性。

3.3 本研究采集螨類(lèi)時(shí)間跨度長(zhǎng)，標(biāo)本運(yùn)輸保存可能影響了核酸質(zhì)量，8組螨核酸僅有4個(gè)樣本擴(kuò)增獲得了COⅠ基因特異性條帶（圖1），且其中只有1個(gè)樣品電泳條帶較亮。核酸質(zhì)量可能也影響了其他基因擴(kuò)增效率。進(jìn)一步優(yōu)化螨類(lèi)標(biāo)本篩檢和核酸提取，可以提高螨類(lèi)分子鑒定的成功率和特異性。