子宮內(nèi)膜癌組織微小RNA-373表達(dá)情況及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移的影響研究

孟圓圓，遲鵬宇，馬麗輝，陳敏，孫冬霞，龐嵐，李燕

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌［1］。EC早期常無(wú)明顯臨床癥狀，確診時(shí)常處于晚期且病情進(jìn)展較快，患者預(yù)后不佳［2］。目前，手術(shù)、放療、藥物或三者聯(lián)合是臨床治療EC的常用手段［3］，經(jīng)治療后患者5年生存率為70%～80%［4］，但EC的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此臨床迫切需要尋找有助于早期診斷及治療EC的靶分子。微小RNA（miRNA）是長(zhǎng)度為l9～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可直接調(diào)控靶基因表達(dá)，參與人類多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［5］。研究表明，miRNA-944在EC組織中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤形成［6］。近年越來(lái)越多研究開(kāi)始關(guān)注miRNA-373在惡性腫瘤（如肝癌［7］、肺癌［8］）發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，但其在EC中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討EC組織miRNA-373表達(dá)情況及其對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月—2013年6月在邯鄲市婦幼保健院行手術(shù)治療的64例EC患者的EC組織作為試驗(yàn)組，患者年齡32～63歲，平均年齡（52.1±6.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷資料完整；（2）病理檢查結(jié)果為EC；（3）術(shù)前未行其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他類型惡性腫瘤者；（2）合并全身感染性疾病者；（3）合并心、肺、肝、腎等重要臟器及血液、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)疾病者。另選取同期在邯鄲市婦幼保健院行子宮切除術(shù)的30例良性子宮肌瘤患者的正常組織作為對(duì)照組。所有組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本研究?jīng)邯鄲市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-373、大型腫瘤抑制基因2（LATS2）檢測(cè)方法 采用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取兩組組織標(biāo)本中總RNA，采用RevertAid RT Reverse Transcription試劑盒（Thermo Fisher Scientific，Inc）進(jìn)行cDNA合成，并應(yīng)用SYBR Green RT-qPCR 試 劑 盒（Kapa Biosystems，Inc.，MA，USA）檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）擴(kuò)增體系為10 ml，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。U6、GAPDH分別作為miRNA-373和LATS2的內(nèi)參。每個(gè)組織標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，應(yīng)用2-ΔΔct法計(jì)算miRNA-373、LATS2相對(duì)表達(dá)量。miRNA-373引物序列： 正 向：5'-GAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3'，反 向：5'-TGCCGCCTGAACTTCACTCC-3'；LATS2引物序列：正向：5'-ATGAGCTCCACTCTGCTC AATGTCACGG-3'， 反 向：5'-GCAAGCTTCTCT ACCAAGAATGAAAGAGCAT-3'；U6引 物 序 列：正 向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH引物序列：正向：5'-GCACCGTCAAG GCTGAGAAC-3'，反向：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.2.2 隨訪 EC患者術(shù)后均進(jìn)行電話及門(mén)診隨訪，并統(tǒng)計(jì)其術(shù)后5年生存情況，終點(diǎn)事件為死亡。

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 細(xì)胞系培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系A(chǔ)N3CA、HEC-1A、HEC-1B和永生化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞T-HESC均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，將各細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640（HyClone，Logan，UT，USA）中，在37 ℃含5%二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱中培育。與T-HESC細(xì)胞相比，AN3CA、HEC-1A、HEC-1B細(xì)胞系中miRNA-373表達(dá)上調(diào)，且HEC-1B細(xì)胞系中miRNA-373表達(dá)上調(diào)最明顯，因此本研究選擇HEC-1B細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miRNA-373模擬物（miRNA-373 mimic）、miRNA-373抑制劑（miRNA-373 inhibitor）及其相對(duì)陰性對(duì)照物（分別為mimic-NC，inhibitor-NC）均購(gòu)自GenePharma（中國(guó)上海）。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，USA） 試 劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別采用miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC轉(zhuǎn)染HEC-1B細(xì)胞，具體操作如下：將3×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在融合度達(dá)到50%時(shí)加入配置好的轉(zhuǎn)染物（10 μl miRNA-373 mimic或miRNA-373 inhibitor或mimic-NC或inhibitor-NC+125 μl無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基+5 μl Lipofectamine 2000試劑）并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，本研究細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為70%。

1.2.3.3 細(xì)胞增殖 采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，具體操作如下：將分別轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC，inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞4×103個(gè)置于96孔板中孵育，分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h后將細(xì)胞在含1 mg/ml 37 ℃MTT無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，去上清液后溶解在二甲基亞砜中（100 ml），采用Molecular Devices酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處讀取吸光度值，以轉(zhuǎn)染時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3.4 細(xì)胞遷移 采用穿梭小室（Transwell）（8 μm孔徑膜）檢測(cè)細(xì)胞遷移，具體方法如下：分別將轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimi、miRNA-373 inhibitor、mimic-NC、inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基溫育24 h，將3×104個(gè)HEC-1B細(xì)胞放入上室中，同時(shí)將含有10% FBS的遞質(zhì)置于下室中，24 h后在37 ℃環(huán)境下完全除去非遷移細(xì)胞；采用4%多聚甲醛固定遷移細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 基因檢測(cè)方法 采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-373與LATS2間的靶標(biāo)關(guān)系，主要技術(shù)流程如下：采用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；將野生型或突變型LATS2〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕的3'-UTR插入pGL3-basic質(zhì)粒載體（Promega，Madison，USA）中，擴(kuò)增、克隆并提純質(zhì)粒備用；將野生型或突變型LATS2和miRNA-373 miminc的3'-UTR轉(zhuǎn)染至HEC-1B細(xì)胞中，24 h后使用DualGlo熒光素酶測(cè)定試劑盒（Promega）檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度以分析熒光素酶活性，并與空載對(duì)照比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；采用Graphpad Prism 6軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線以分析不同miRNA-373表達(dá)情況EC患者術(shù)后5年預(yù)后，采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果

2.1.1 miRNA-373表達(dá)情況 對(duì)照組miRNA-373相對(duì)表達(dá)量為（0.48±0.17），試驗(yàn)組為（1.32±0.29）；試驗(yàn)組miRNA-373相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.634，P=0.008）。

2.1.2 術(shù)后5年預(yù)后 根據(jù)miRNA-373平均值將試驗(yàn)組患者分為低表達(dá)組（n=26）和高表達(dá)組（n=38），Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達(dá)組患者術(shù)后5年累積生存率為52.6%，低于低表達(dá)組的84.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.682，P=0.020，見(jiàn)圖1）。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 LATS2表達(dá) 轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞LATS2相對(duì)表達(dá)量為（0.42±0.06），低于轉(zhuǎn) 染 mimic-NC的 HEC-1B細(xì) 胞 的（0.91±0.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.143，P=0.032）；轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞LATS2相對(duì)表達(dá)量為（2.03±0.02），高于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞的（1.11±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.626，P=0.014）。

2.2.2 細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染96 h后，轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞吸光度值高于轉(zhuǎn)染mimic-NC的HEC-1B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.499，P=0.023，見(jiàn)圖2A）；轉(zhuǎn)染96 h后，轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞吸光度值低于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.256，P=0.015，見(jiàn)圖2B）。

圖1 不同miRNA-373表達(dá)情況EC患者術(shù)后5年生存情況的Kaplan-Meier生存曲線Figure 1 Kaplan-Meier survival curve for postoperative five-year survival status in EC patients with different expression of miRNA-373

2.2.3 細(xì)胞遷移 轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)量為（178±12）個(gè)，多于轉(zhuǎn)染mimic-NC的HEC-1B細(xì)胞的（77±25）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.585，P=0.006）；轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)量為（25±6）個(gè)，少于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞的（70±10）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.061，P=0.002）。

2.3 基因檢測(cè)結(jié)果 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LATS2含有miRNA-373的潛在結(jié)合位點(diǎn)（見(jiàn)圖3）。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，野生型LATS2中miRNA-373相對(duì)熒光強(qiáng)度為（0.24±0.05），低于空載對(duì)照的（0.96±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.287，P＜0.01）；突變型LATS2中miRNA-373相對(duì)熒光強(qiáng)度為（0.98±0.04），與空載對(duì)照的（0.96±0.07）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.281，P=0.928）。

圖2 miRNA-373 mimic、miRNA-373 inhibitor轉(zhuǎn)染HEC-1B細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值變化Figure 2 Changes of optical density in HEC-1B cells after transfection of miRNA-373 mimic or miRNA-373 inhibitor at different time points

圖3 LATS2結(jié)合位點(diǎn)和miRNA-373基因啟動(dòng)子的示意圖Figure 3 Schematic diagram for LATS2 binding site and miRNA-373 gene promoter

3 討論

EC患者常無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，但患者病情進(jìn)展快、發(fā)病過(guò)程復(fù)雜、預(yù)后差。隨著近年科學(xué)技術(shù)發(fā)展，EC的診斷和治療雖有了很大程度改善，但EC晚期患者生存率仍較低，預(yù)后仍不樂(lè)觀［9］。研究表明，miRNA可通過(guò)靶向癌基因或抑制癌基因而延緩癌癥進(jìn)展，且多種miRNA在癌癥患者中存在異常表達(dá)［6］。miRNA-373是miRNA的一員，參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如腎細(xì)胞癌［10］、胃癌［8］等。譚飛非等［11］研究結(jié)果顯示，miRNA-373在EC組織中呈高表達(dá)，但其潛在作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組miRNA-373相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且高表達(dá)組患者術(shù)后5年累積生存率低于低表達(dá)組，提示miRNA-373有可能作為早期診斷EC并預(yù)測(cè)EC患者不良預(yù)后的生物學(xué)靶分子。

miRNA-373與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2006年，VOORHOEVE等［12］首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)miRNA-373是致癌基因，并可促進(jìn)惡性腫瘤形成。近年研究表明，在食管鱗狀細(xì)胞癌中miRNA-373會(huì)通過(guò)抑制TIMP3表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力［8，12］；在肝癌中，miRNA-373 inhibitor可通過(guò)下調(diào)miRNA-373的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染96 h后，轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞吸光度值高于轉(zhuǎn)染mimic-NC的HEC-1B細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞吸光度值低于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)量于轉(zhuǎn)染mimic-NC的HEC-1B細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞中遷移細(xì)胞少于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞，提示miRNA-373表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)EC細(xì)胞增殖、遷移，而下調(diào)其表達(dá)則可抑制EC細(xì)胞增殖、遷移，與miRNA-373 在胃癌［13］、纖維肉瘤［14］、膀胱癌［15］中的作用相似。也有研究表明，miRNA-373在結(jié)腸癌［15］、膠質(zhì)瘤［16］、非小細(xì)胞肺癌［17］中具有抑癌作用，分析其原因可能為：惡性腫瘤形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，并受到多種因素影響，miRNA-373在不同腫瘤中可能通過(guò)不同途徑發(fā)揮促癌或抑癌作用。

LATS2是Hippo途徑的重要組成部分，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲過(guò)程中具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［18］。研究表明，LATS2作為一種腫瘤抑制因子，可下調(diào)B淋巴細(xì)胞-2基因（Bcl-2）和B淋巴細(xì)胞-xl基因（Bcl-xl）并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］；此外，LATS2高表達(dá)還能通過(guò)抑制素鼠雙微體蛋白2（Mdm2）的E3泛素連接酶活性而導(dǎo)致G1/S期細(xì)胞周期停滯［20］。此外，miRNAs主要通過(guò)調(diào)控靶基因而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程，而LATS2作為抑癌基因已被多種miRNAs作為靶向位點(diǎn)，如LATS2可作為miRNA-135b靶向位點(diǎn)并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖［21］。GAO等［22］研究表明，miRNA-31可通過(guò)Hippo途徑而抑制LATS2表達(dá)，進(jìn)而激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，LATS2含有miRNA-373的潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示EC組織細(xì)胞中miRNA-373可直接靶向調(diào)節(jié)LATS2的表達(dá)。值得注意的是，已有研究證實(shí)，miRNA-373轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)LATS2的表達(dá)并刺激人食管癌細(xì)胞增殖［23］。本研究結(jié)果顯示，野生型LATS2中miRNA-373相對(duì)熒光強(qiáng)度低于空載對(duì)照，突變型LATS2中miRNA-373相對(duì)熒光強(qiáng)度與空載對(duì)照比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimic的HEC-1B細(xì)胞LATS2相對(duì)表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染mimic-NC的HEC-1B細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染miRNA-373 inhibitor的HEC-1B細(xì)胞LATS2相對(duì)表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染inhibitor-NC的HEC-1B細(xì)胞，提示miRNA可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)LATS2的表達(dá)而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖、遷移。

綜上所述，miRNA-373在EC組織中呈高表達(dá)，其可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)LATS2的表達(dá)而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而影響EC患者預(yù)后，這為EC發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)；但本研究未探討miRNA-373調(diào)節(jié)LATS2的具體機(jī)制，仍需后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

作者貢獻(xiàn)：孟園園、李燕進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；遲鵬宇、馬麗輝、陳敏進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；龐嵐進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并指導(dǎo)撰寫(xiě)論文；孫冬霞進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。