枯草芽孢桿菌和綠色木霉協(xié)同促進芹菜生長的研究

周 游 ，楊臘英 ，汪 軍 ，郭立佳 ，梁昌聰 ，劉 磊 ，黃俊生 *

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所，海南 ?？?571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，海南 ?？?571101）

芹菜（Apium graveolens L.）富含蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷、鐵等20多種營養(yǎng)物質(zhì)，是我國國民廣泛食用的蔬菜［1-2］。隨著對芹菜需求的日益加大，不少學(xué)者通過提高大量元素供給，施用黃腐酸鉀和生長調(diào)節(jié)劑等物質(zhì)，或者利用微生物等手段研究提高芹菜產(chǎn)量的方法［3-6］。

前人研究表明，復(fù)合使用不同類型的微生物比使用單一微生物對植物的促生和控制植物病害的效果更好，呈現(xiàn)增效作用［7-9］?？赡艿脑蚴遣煌愋偷奈⑸飳χ参锖蛯Σ≡淖饔梅绞讲煌?，分泌的作用物質(zhì)也不同［10-11］。有研究表明，不同種類的微生物共同培養(yǎng)后會加大有益物質(zhì)的分泌，例如Trichoderma asperellum和Bacillus amyloliquefaciens共同培養(yǎng)后會加大D-天冬氨酸等8種氨基酸的分泌［12］。并且不同種類菌株共同培養(yǎng)時會誘導(dǎo)單獨培養(yǎng)時沉默基因的表達，Schroeckh等發(fā)現(xiàn)，Streptomyces hygroscopicus（現(xiàn)為S.rapamycinicus）和Aspergillus nidulans共培養(yǎng)后，能激活A(yù).nidulans沉默的polyketide synthase（PKS）基因簇表達［13］。值得注意的是，不同種類菌株共同培養(yǎng)也能誘導(dǎo)產(chǎn)生新的物質(zhì)，Dashti等將 Actinokineospora sp.和Nocardiopsis sp.共同培養(yǎng)后分離出在單獨存在的情況下不能產(chǎn)生的3種新物質(zhì)［14］。但以往研究多關(guān)注于兩種微生物之間的相互作用結(jié)果，而關(guān)于復(fù)合微生物促進植物生長的協(xié)同增效機制尚不清楚，且研究報道極為鮮見。木霉和芽孢桿菌是目前廣泛用來生產(chǎn)微生物菌肥的菌種。因此，本研究通過比較綠色木霉和枯草芽孢桿菌在單獨和混合施用情況下，對芹菜的防御酶活性和代謝物含量的影響情況來探明這兩種微生物對芹菜生長的協(xié)同增效作用的機制。這將為微生物的復(fù)合使用提供理論基礎(chǔ)，也為芹菜的高產(chǎn)栽培提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

①枯草芽孢桿菌（BLG010）（專利號：CN102747020A）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供，菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5953。將BLG010接種在LB液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下180 r/min黑暗培養(yǎng)2 d后離心去除LB培養(yǎng)液獲得純孢子體，并用無菌蒸餾水把孢子稀釋成1.0×107個/mL濃度的孢子懸浮液。

②綠色木霉（H06）（專利號：CN102839131A）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6229。將H06接種到PDA平板上，在27℃條件下黑暗培養(yǎng)9 d，并刮取孢子用無菌蒸餾水制成孢子懸浮液（濃度為1.0×107個/mL）；

1.2 盆栽試驗

2018年1月3日將長至5～6 cm的西芹幼苗移栽至混合有滅菌的菜園土、營養(yǎng)土以及椰糠作為栽培基質(zhì)的花盆中，幼苗移栽時各花盆均施用市購復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）1∶900倍液500 mL。移栽5 d后按以下4個處理澆灌芹菜，每處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)含12株芹菜。移栽30 d后收獲芹菜，測定株高和鮮重。

①蒸餾水處理（CK）：每花盆澆灌300 mL 的無菌蒸餾水。

②BLG010處理：每花盆澆灌300 mL的BLG010 孢子懸浮液（1.0×107個/mL）。

③H06處理：每花盆澆灌300 mL 的H06 孢子懸浮液（1.0×107個 /mL）。

④BLG010+H06處理：每花盆澆灌各150 mL的BLG010和H06孢子懸浮液（1.0×107個/mL）。

1.3 酶活性測定

分別于處理后10、20 d時采集4個處理的距離地面1～5 cm處莖稈用于提取總酶液，每6個莖稈作為一個重復(fù)。根據(jù)吳衛(wèi)等的方法獲得含有過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的總酶液［15］。過氧化氫酶（CAT）活性利用H2O2測定［16］；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［17］。

1.4 差異代謝物GC-MS分析

分別于處理后10、20 d時采集4個處理的距離地面1～5 cm處莖稈用于代謝物檢測，每6個莖稈作為一個重復(fù)。氣質(zhì)聯(lián)用儀型號為Thermo TRACE1310/ISQTMQD GC-MS。

①代謝物提取及衍生化：根據(jù)Lisec等的方法提取代謝物，以核糖醇（0.2 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)［18］。利用甲氧基胺基鹽酸鹽吡啶溶液（吡啶含量為20 mg/mL）與N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含1% 三甲基氯硅烷）對代謝物進行衍生化。

②色譜和質(zhì)譜條件：毛細管色譜柱為Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μ m），不分流進樣，1.0 mL/min恒流模式。升溫程序為：初始溫度80℃，維持2 min，然后以5℃/min的速度升至300℃，維持1 min。進樣口溫度設(shè)定為 250℃。EI離子源，溫度250℃，電子轟擊電壓為70 eV。質(zhì)譜檢測范圍為45～600 m/z。每0.2 s掃描一次，溶劑延遲3 min。樣品采用隨機順序連續(xù)自動進樣。

③數(shù)據(jù)處理：對樣品的總離子圖進行色譜峰識別，并與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對，鑒定代謝物的種類，使用自動積分方法進行積分并進行手動積分校正，對代謝產(chǎn)物進行的定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對芹菜生長的影響

由圖1和圖2可見，同時澆灌枯草芽孢桿菌（BLG010）和綠色木霉（H06）的處理比其它處理長勢良好。BLG010+H06處理的株高分別是CK、BLG010、H06處理的1.44、1.13、1.21倍；株重分別是CK、BLG010、H06處理的3.4、1.39、2.07倍，這說明BLG010和H06對芹菜的促生具有協(xié)同增效作用。

圖1 不同處理對芹菜生長的影響

圖2 不同處理對芹菜株高和株重的影響

2.2 不同處理對芹菜酶活性的影響

經(jīng)過分析得知，CAT與POD活性在4個處理間表現(xiàn)出規(guī)律性變化。由圖3和圖4可知，BLG010+H06處理的CAT和POD活性在第10 d和第20 d時均比其它處理高，CK處理在第10 d和第20 d時的POD和CAT活性均比其它處理低。

圖3 不同處理對芹菜CAT活性的影響

圖4 不同處理對芹菜POD活性的影響

圖5 芹菜代謝物GC-MS總離子流色譜圖

在 第10 d時，BLG010+H06處 理 的POD活性分別為BLG010和H06處理的1.23和1.36倍；BLG010+H06處理的CAT活性分別為BLG010和H06處理的1.03和1.4倍。

在 第20 d時，BLG010+H06處 理 的POD活性分別為BLG010和H06處理的1.25和1.22倍；BLG010+H06處理的CAT活性分別為BLG010和H06處理的1.78和1.45倍。

由結(jié)果可知，BLG010和H06均能提高芹菜CAT和POD活性，但是同時澆灌BLG010和H06比單獨澆灌BLG010或H06對芹菜的CAT和POD活性具有更強的誘導(dǎo)能力，這也說明BLG010和H06對芹菜防御酶活性誘導(dǎo)具有協(xié)同增效作用。

2.3 不同處理對芹菜代謝物的影響

各處理樣品的GC-MS 總離子流色譜圖峰形較好（圖5），可根據(jù)峰面積計算代謝物質(zhì)相對含量和通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫確認(rèn)各峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由結(jié)果可知，蘋果酸、甘露醇和蔗糖這3種物質(zhì)相對含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異。

與CK處理相比，BLG010、H06、BLG010+H06處理的甘露醇含量在第10 d和20 d兩個時間點均上調(diào)表達（圖6），處理間的含量大小順序為：BLG010+H06＞BLG010＞H06＞CK 處理。

由圖7可知，與CK處理相比，BLG010+H06處理的蘋果酸含量在第10 d和20 d兩個時間點均上調(diào)表達，而BLG010處理、H06處理的蘋果酸含量在第10 d表達下調(diào)，但隨后BLG010處理的蘋果酸含量在第20 d上調(diào)表達。

圖6 不同處理對芹菜甘露醇含量的影響

圖7 不同處理對芹菜蘋果酸含量的影響

由圖8可知，在第10 d，CK處理的蔗糖含量分別是BLG010、H06、BLG010+H06處理蔗糖含量的5.78、2.33和7.01倍。但是在第20 d時，BLG010、H06、BLG010+H06處理的蔗糖含量分別是CK處理蔗糖含量的1.98、1.3和7.22倍。

結(jié)果表明，接種枯草芽孢桿菌或綠色木霉均能引起芹菜的蘋果酸、甘露醇和蔗糖含量變化，而混合接種枯草芽孢桿菌和綠色木霉則能導(dǎo)致這些變化程度加大。

3 結(jié)論與討論

POD和CAT是植物生長過程中的重要抗性相關(guān)酶，其活性變化情況是反映植物抗病性的重要生理指標(biāo)［19-20］，眾多學(xué)者利用生防菌接種寄主植物來提高寄主的CAT和POD活性，由此使寄主獲得誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance，ISR）。因此，測定枯草芽孢桿菌和綠色木霉在單獨和混合施用條件下對芹菜的CAT和POD活性影響，能探明這兩種生防菌對芹菜的防御酶是否有增效作用，也間接為其它生防菌的復(fù)合使用提供理論支撐。

圖8 不同處理對芹菜蔗糖含量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和綠色木霉均能提高芹菜CAT和POD活性，且兩者混合接種芹菜提高這兩種酶的活性更高，呈現(xiàn)增效作用，這可能是兩種生防菌對芹菜的刺激比單一生防菌的刺激作用強，加強了激活CAT和POD活性的過程，這和前人的報道類似［21-22］，他們發(fā)現(xiàn)接種病原菌和芽孢桿菌處理的CAT和POD等抗性相關(guān)酶活性比只單獨接種病原菌或者生防菌的高。

本研究也發(fā)現(xiàn)，株高最高和株重最重的芹菜處理，其CAT和POD活性也最大，這與呂斌等［23］和趙英等［24］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)POD和SOD等抗性相關(guān)酶的活性與植物的生長勢有相關(guān)關(guān)系。因此將來可以進行深入的研究，探清芹菜CAT和POD活性與芹菜株高與株重的相關(guān)關(guān)系，作為預(yù)測微生物提高芹菜產(chǎn)量能力的檢測指標(biāo)。

代謝物的變化可視為植物對外界環(huán)境變化的響應(yīng)，研究植物響應(yīng)外源微生物的代謝組不僅能描述植物的狀態(tài)，也能了解植物與微生物互作的機制。本文對4個處理的芹菜進行代謝組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異，這些差異變化是芹菜對枯草芽孢桿菌和綠色木霉的響應(yīng)。

蘋果酸是三羧酸（TCA）循環(huán)的中間產(chǎn)物，參與多種代謝反應(yīng)的調(diào)控，能生成蔗糖、丙酮酸、草酰乙酸等物質(zhì)，是一種重要的能量物質(zhì)［25］。本研究中，在兩個時間段，BLG010+H06處理的蘋果酸均比CK處理和其它處理高，這與董鮮等［26］和張風(fēng)革［27］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)植物接種微生物后，其體內(nèi)的蘋果酸含量上調(diào)。造成這種現(xiàn)象的可能原因是，芽孢桿菌和木霉對蘋果酸具有趨化性，蘋果酸可作為芽孢桿菌和木霉的營養(yǎng)來源之一，芹菜加大蘋果酸的分泌能促進這兩種微生物在植物根部定殖［27-28］；也有可能是，在兩種生防菌的共同作用下，刺激芹菜上調(diào)蘋果酸產(chǎn)量進而轉(zhuǎn)化為糖類，為芹菜的生長發(fā)育提供能量，從而達到顯著促進芹菜生長的目的。但是，第10 d時BLG010處理和H06處理、第20 d時H06處理的蘋果酸含量均比CK處理低，具體機理有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，BLG010和H06均能誘導(dǎo)芹菜甘露醇累積，并且兩種生防菌共同處理的芹菜甘露醇相對含量比單一生防菌處理的高，這和Luo等［29］的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)利用菌根真菌接種楊樹后，甘露醇在楊樹體內(nèi)累積。甘露醇是植物體內(nèi)重要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)［30］，微生物與植物作用后會導(dǎo)致植物的滲透勢發(fā)生改變［31］，由此推測，芽孢桿菌和木霉處理芹菜導(dǎo)致其甘露醇累積的原因可能是，芹菜需要調(diào)節(jié)由這兩種微生物造成的滲透壓失衡，故而加大甘露醇的分泌，并且兩種微生物比單一微生物使芹菜累積甘露醇的作用更強，但是甘露醇與芹菜生長勢之間的關(guān)系需要進一步研究。

蔗糖能分解成果糖和葡萄糖，是植物體內(nèi)重要的能源物質(zhì)也是分子信號，是源庫碳水化合物代謝的樞紐，能影響植物生長發(fā)育過程中的基因表達［32-33］。植物根系的蔗糖是木霉的能量來源，但是木霉獲得足夠的蔗糖后就下調(diào)其自身的蔗糖水解酶活性，以避免其對寄主蔗糖的過量吸收而導(dǎo)致寄主組織的破壞［34］。鄒英寧等［35］研究表明，柑橘接種叢枝菌根真菌能提高其株高和葉片數(shù)以及葉片蔗糖含量，經(jīng)分析得知菌根侵染率與葉片蔗糖含量正相關(guān)，他們認(rèn)為葉片產(chǎn)生的蔗糖向根部運輸并分解為葡萄糖和果糖供給菌根真菌吸收利用。本研究結(jié)果表明，在第10 d時，各處理的蔗糖含量表現(xiàn)為CK處理＞BLG010處理＞H06處理＞BLG010+H06處理，在第20 d時各處理的蔗糖含量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為BLG010+H06處理＞BLG010處理＞H06處理＞CK，這可能的原因是在枯草芽孢桿菌和綠色木霉定殖根部初期，芹菜產(chǎn)生的蔗糖向下運輸給這兩種生防菌使用，導(dǎo)致莖部蔗糖含量變低，當(dāng)它們獲得足夠的蔗糖后產(chǎn)生調(diào)節(jié)信號給芹菜，芹菜調(diào)節(jié)蔗糖相關(guān)酶的活性，提高體內(nèi)蔗糖含量用于促進自身生長。這與劉春娟等［36］的研究類似，他們發(fā)現(xiàn)大豆葉片的蔗糖含量與大豆的產(chǎn)量正相關(guān)。本研究中，BLG010和H06聯(lián)合接種對提高芹菜的蔗糖含量呈現(xiàn)出了增效效應(yīng)，這可能是BLG010和H06促進芹菜生長呈現(xiàn)協(xié)同增效現(xiàn)象的原因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌（BLG010）和綠色木霉（H06）能促進芹菜的生長，并且同時接種BLG010和H06比單獨接種BLG010或H06促進芹菜生長的效果更好。同時還發(fā)現(xiàn)，芹菜CAT和POD活性、蘋果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同處理間呈現(xiàn)規(guī)律性的差異，這些差異變化可能是枯草芽孢桿菌和綠色木霉促進芹菜生長呈現(xiàn)協(xié)同增效的原因。這些研究結(jié)果將為生防菌的復(fù)合使用提供新思路，為芹菜的高產(chǎn)栽培提供技術(shù)支撐。