湖北省地方杏品種資源熒光SSR遺傳多樣性分析

摘要：為探明湖北省地方杏品種資源的遺傳多樣性，以湖北省24個地方杏品種為試驗材料，采用SSR分子標記結合熒光毛細管電泳技術開展研究。結果表明，來自杏、桃、扁桃和櫻桃上的14對引物共擴增出162個多態(tài)性等位基因位點，平均每個位點的等位基因數(shù)目為11.571。有效等位基因總數(shù)為90.312，平均每個位點的有效等位基因數(shù)目為6.451。觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農指數(shù)（I）的平均值分別為0.652、0.813、2.031，多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.794，說明所選近源物種的引物具有較高的通用性，多態(tài)性豐富。在相似系數(shù)0.580處將24個品種分為3個大組，第1組由洪平杏獨立成組，第2組由榔梅、杏梅等4個品種組成，第3組由米杏、五祖杏等19個品種組成。可見，湖北省地方杏品種具有豐富的遺傳多樣性，采用SSR特異性引物可以鑒別湖北省地方杏品種。

關鍵詞：地方杏；種質資源；熒光SSR標記；遺傳多樣性；湖北省

中圖分類號：S662.2 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）10-0097-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.017 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract：To explore the genetic diversity of local apricot variety resources in Hubei Province， 24 local apricot varieties materials were taken as test materials， and SSR molecular markers combined with fluorescence capillary electrophoresis technology were used for the study. The results showed that 14 pairs of primers from apricots， peaches， almonds， and cherries amplified a total of 162 polymorphic effective allele loci， with an average of 11.571 alleles per locus. The total number of effective alleles was 90.312， with an average of 6.451 effective alleles per locus. The average values of observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， and Shannon's information index （I） were 0.652， 0.813， and 2.031， respectively. The average value of polymorphic information content （PIC） was 0.794， indicating that the primers for the selected related species had high universality and rich polymorphism. At a similarity coefficient of 0.580， 24 varieties were divided into three large groups. The first group was independently composed of Hongping apricot， the second group consisted of four varieties including Langmei and Xingmei et al， and the third group consisted of 19 varieties including rice apricot and Wuzu apricot. It could be seen that local apricot varieties in Hubei Province had rich genetic diversity， and SSR specific primers could effectively identify Hubei local apricot varieties.

Key words：local apricot； germplasm resources； fluorescent labeled SSR marker； genetic diversity； Hubei Province

杏（Prunus armeniaca L.）屬于薔薇科，在世界范圍內廣泛種植，它是北半球的重要水果，也是除桃和李之外的第三大硬核水果。在所有的溫帶水果中，杏在全球產量中排名第七［1］。中國約有2 000個杏的品種和類型，有著悠久的栽培歷史，不僅是杏的原產國之一，也是世界上杏種質資源最豐富的國家［2］。普通杏是杏屬中品種最多、栽培最廣泛、經濟價值最高的一個種，它在世界各地的大部分地區(qū)種植，主要是在地中海盆地、北美和亞洲，栽培了廣泛的品種類型［3］。地方杏資源的遺傳多樣性研究對中國杏的生產和科研都具有重要意義。

SSR標記，也稱為微衛(wèi)星DNA標記或短串聯(lián)重復序列標記，是高變DNA元件，由串聯(lián)重復的單、二、三、四核苷酸或五核苷酸基序組成，它們大量存在于高等生物的基因組中［4］。近些年，SSR標記已在野杏、地方杏和普通杏等中廣泛應用［5-9］，具有高水平的多態(tài)性、位點特異性、共顯性、可重復性、PCR方便、全基因組隨機分布等優(yōu)點［10］。

目前，杏樹上主要利用SSR標記進行遺傳多樣性分析。Hedia等［1］利用25個SSR標記，對從杏栽培地區(qū)收集的890份不同杏品種材料進行基因分型，分析了栽培杏的遺傳多樣性和遺傳資源的結構，揭示了該品種在世界范圍內的傳播歷史，證實了杏自中國和中亞的起源。何天明等［11］利用SSR標記進行了新疆栽培杏的群體遺傳結構分析；張淑青等［12］利用SSR標記對69個普通杏品種進行了遺傳多樣性分析；王玉安等［13］利用SSR標記對甘肅地方杏品種資源進行了遺傳多樣性分析。熒光SSR相對于SSR檢測技術，在檢測速度和檢測效果上都有更明顯的優(yōu)勢［14，15］。近年來，熒光SSR標記在果樹上得到應用。苑克俊等［15］利用熒光SSR標記構建杏新品系的分子身份證；王璐偉等［16］采用熒光SSR標記對79份桃種質進行遺傳多樣性分析。這些研究主要是針對普通杏、中國北方的地方杏品種資源。

然而，對湖北省范圍內杏種質資源的研究報道較少，本研究旨在對湖北省11個縣（市）的 24份地方杏資源進行基于熒光標記的SSR遺傳多樣性分析，以期為利用中國地方杏品種進行育種改良獲得新品種提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用24份地方杏資源葉片樣本來源于湖北省農業(yè)科學院果樹茶葉研究所金水試驗基地杏資源圃（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份杏種質材料取幼嫩葉片約30 mg，液氮冷凍后研磨，采用改良CTAB法提取葉片基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用ND-100微量紫外分光光度計（美國Thermo）檢測純度和濃度，稀釋至50 mg/L，保存于 -20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 SSR引物合成 參考已報道的相關文獻，從杏、扁桃、桃、櫻桃的引物中合成18對SSR引物，篩選出14對多態(tài)性好的引物，序列見表2。由北京擎科生物科技股份有限公司合成。所有F引物的5′端合成修飾引物，可選FAM、HEX、TAMRA、ROX 4種修飾。R引物合成PAGE引物。

1.2.3 PCR反應體系與擴增程序 PCR反應采用20 μL體系：TSINGKE金牌Mix（green）17 μL、正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL。

PCR反應程序為：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min后4 ℃保存。4種熒光標記體系及擴增程序同上。

1.2.4 電泳及毛細管檢測 擴增好的PCR產物zK6CLGZR2vmoJvxbJuYtDw==進行瓊脂糖凝膠電泳（2 μL樣品+6 μL溴酚藍），300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖。通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到毛細管電泳所需濃度。將分別帶有4種熒光標記的PCR產物進行混樣，加入LIZ 500內標Marker后在ABI3730XL測序儀進行基因分型。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 將經ABI3730XL測序儀測序后獲得的結果在GeneMapper 4.1軟件上進行分析，校正后進行片段大小分析，將讀取后的數(shù)據(jù)錄入Excel，進行進一步的分析。對PCR擴增沒有結果的樣品重復驗證該位點有無擴增片段。分析數(shù)據(jù)按照引物對應關系的核心堿基重復數(shù)來確定位點準確大小。每對引物單獨分析并得出數(shù)據(jù)，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

使用GenALEx軟件對24份杏資源樣本的觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農指數(shù)（I）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、無偏期望雜合度（uHe）以及固定系數(shù)（F）等多樣性指數(shù)進行分析。通過PowerMarker軟件分析獲得多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)據(jù)，基于Nei的遺傳距離獲得聚類數(shù)據(jù)，使用MEGA6軟件繪制UPGMA樹，進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 熒光SSR引物篩選

熒光SSR標記PCR產物經毛細管電泳檢測后獲得電泳圖片和等位基因數(shù)據(jù)。圖1、圖2分別為PMS2、ASSR71標記引物在1個杏品種上的擴增產物帶型，峰型尖銳鋒利，周圍有若干小峰，無明顯雜峰，說明引物特異性較好，適合杏種質資源的相關研究。參考已報道的相關文獻，從杏、扁桃、桃、櫻桃的引物中篩選18對引物進行試驗，最終獲得14對適用于杏種質資源研究的SSR標記引物。

2.2 不同引物的遺傳多樣性分析

利用14對引物對24份湖北杏種質資源進行DNA擴增，共擴增出162個多態(tài)性等位基因位點（Na，表3）。其中，最小的等位基因數(shù)目為6.000（ASSR71），最大的等位基因數(shù)目為18.000（AMPA105），平均每個位點的等位基因數(shù)目為11.571。有效等位基因總數(shù)為90.312，數(shù)值變化范圍在2.887（ASSR71）～11.520（AMPA105），平均每個位點的有效等位基因數(shù)目為6.451。有效等位基因數(shù)低于觀測等位基因數(shù)，表明在基因組中存在一些高頻率的等位基因。各位點的觀測雜合度（Ho）變異幅度在0.417（UDP97-402）～0.833（AMPA112），平均Ho為0.652，期望雜合度（He）在0.654（ASSR71）～0.913（AMPA105），平均He為0.813，說明試驗材料具有較高的多態(tài)性，分子標記質量較好。香農指數(shù)（I）范圍在1.302（ASSR71）～2.638（AMPA105），平均值為2.031。多態(tài)性信息含量（PIC）數(shù)值范圍在0.610（ASSR71）～0.907（AMPA105），平均值為0.794，其中所有引物的多態(tài)性信息含量均在0.600以上，說明試驗使用的引物多態(tài)性較高。由以上結果可以看出，所選的標記具有豐富的多態(tài)性，能在分子水平上準確反映各品種間的遺傳關系，同時也說明24份湖北省地方杏樣本在分子水平上具有較高的遺傳多樣性。

2.3 聚類分析

為了解湖北杏種質資源之間的遺傳關系，在PowerMarker中對24份資源的遺傳距離進行計算?；贜ei的遺傳距離［22］，使用MEGA6軟件進行個體的UPGMA樹聚類分析（圖3）。

根據(jù)聚類分析結果，在相似系數(shù)0.580處將24份資源分為3組。

第1組由洪平杏獨立成組。洪平杏是杏屬內一狹域分布種，僅見于神農架林區(qū)。關于洪平杏在杏屬的分類地位一直有爭議，有學者根據(jù)形態(tài)學推測其可能為梅和杏的天然雜交種，也有學者依據(jù)形態(tài)研究認為其為梅的一個變種，另有相關形態(tài)研究表明其為一個獨立的種，但與梅的關系更近。

第2組由榔梅、杏梅、老杏梅、桃李杏4個品種組成。其中榔梅來自丹江口市，杏梅和老杏梅來自鐘祥市，桃李杏來自大悟縣。丹江口市的榔梅與鐘祥市的杏梅沒有區(qū)分開，疑似同名異物資源。榔梅、杏梅、桃李杏3個品種親緣關系非常近。

第3組由19個品種組成。來源于巴東縣的米杏與黃梅縣的五祖杏、大河杏（1）、大河杏（2）聚成小組，大悟縣的小麥杏與廣水市的中熟杏、秭歸縣的荷包杏與秭歸本地杏（2）聚成小組。

3 小結與討論

本研究采用熒光SSR分子標記技術分析了湖北省地方杏品種資源的遺傳變異和親緣關系。用14對SSR特異性引物擴增出豐富的多態(tài)性條帶，顯示出所用引物具有較高的鑒別湖北省地方杏品種資源的能力。SSR位點的特征指數(shù)數(shù)據(jù)，如雜合度、香農指數(shù)等，揭示了湖北省地方杏品種具有豐富的遺傳變異性。本研究結果為進一步分析和利用湖北省杏品種資源提供了理論依據(jù)。

目前，SSR熒光標記毛細管電泳技術在杏上已有應用，主要用于種質遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、種質鑒定、親本分析等方面。但是全世界范圍類已開發(fā)的杏SSR標記都較少，近源物種的SSR分子標記具有較高的通用性，杏種質資源的研究大多采取近源物種的SSR分子標記。本試驗選用的14對引物中，除杏引物3對外，還有近源物種桃引物7對、扁桃引物2對和櫻桃引物2對。

14對SSR引物在24份杏種質中共檢測到162個等位基因（Na），平均每個位點11.571個；多態(tài)信息含量（PIC）為0.610～0.907，均值為0.794，本研究結果表明近緣植物SSR分子標記在杏種質資源中具有較高的通用性，與斯欽畢力格等［8］、張淑青等［12］的研究結論一致。除杏引物外，相對于扁桃、櫻桃來說，普通桃SSR引物在杏中的種質多態(tài)性最高，適合作為杏種質資源研究的SSR分子標記不足的補充。

聚類分析結果顯示，14對引物未能將來自丹江口市的榔梅與鐘祥市的杏梅進行有效區(qū)分，兩份資源是否為同物異名資源，需要進一步研究。同名的小麥杏資源有3份，分別來自鐘祥市、大悟縣、廣水市，根據(jù)DNA擴增結果3份資源存在明顯差異，說明3份資源為同名異物資源。同名為杏梅的資源有3份，1份來自鐘祥市，另外2份來自廣水市，根據(jù)DNA擴增結果3份資源存在明顯差異，說明3份資源為同名異物資源。通過SSR分子標記擴增，有效區(qū)分了湖北省的部分同名杏品種，甚至是同一區(qū)（縣）的同名物種，對湖北省地方同名異種品種的鑒定提供了有效的篩選SSR分子標記。

參考文獻：

［1］ HEDIA B，IVAN S，CHRISTOPHER S， et al. Genetic structure of a worldwide germplasm collection of P_{+fTcgAriTUbL5tG1JggT02zRy9cYGMJrUMa/TGm0ODM=}runus armeniaca L. reveals three major diffusion routes for varieties coming from the species’ center of origin［J］. Frontiers in plant science， 2020，11： 1-17.

［2］ 張加延. 全國李與杏資源考察報告［J］. 中國果樹，1990（4）：29-34.

［3］ HAGEN L S， CHAIB J， FADY B， et al. Genomic and cDNA microsatellites from apricot （Prunus armeniaca L.）［J］. Molecular ecology notes， 2004， 4： 742-745.

［4］ DIETHARD T. Hypervariabflity of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers［J］. Nucleic acids research， 1989， 17（16）： 6463-6471.

［5］ 劉志琨，陳雪峰，王 端，等. 基于SSR標記的普通杏種質資源遺傳多樣性分析 ［J/OL］. 分子植物育種， 1-22［2023-07-24］.

［6］ 董勝君，溫佳星，盧彩云，等. 野杏經濟性狀SSR關聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異挖掘 ［J］. 經濟林研究， 2022， 40（2）： 71-82.

［7］ 趙海娟，章秋平，馬小雪，等. 杏高通量熒光SSR檢測體系及分子身份證的構建 ［J］. 分子植物育種， 2023， 21（24）： 8134-8143.

［8］ 斯欽畢力格，包文泉. 用于杏種質資源遺傳多樣性分析的SSR引物的篩選 ［J］. 分子植物育種， 2019， 17（5）： 1551-1557.

［9］ 董勝君，王新鑫，張皓凱，等. 基于SSR標記的東北杏遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建 ［J］. 沈陽農業(yè)大學學報，2021，52（6）： 668-676.

［10］ FORSTER B P，RUSSELL J R， ELLIS R P. Locating genotypes and genes for abiotic stress tolerance in barley： A strategy using maps， markers and the wild species［J］. New Phytol，1997，137：141-147.

［11］ 何天明，陳學森，高疆生，等.新疆栽培杏群體遺傳結構的 SSR分析［J］.園藝學報，2006，33（4）：809-812.

［12］ 張淑青，劉冬成，劉威生，等.普通杏品種SSR遺傳多樣性分析［J］.園藝學報，2010，37（1）：23-30.

［13］ 王玉安，歐巧明，陳建軍，等.甘肅地方杏品種資源的SSR遺傳多樣性分析［J］.西北農業(yè)學報，2013，22（3）：98-100.

［14］ 趙海娟，章秋平，馬小雪，等. 杏高通量熒光SSR檢測體系及分子身份證的構建［J］. 分子植物育種，2023，21（24）： 8134-8143.

［15］ 苑克俊，牛慶霖，葛福榮，等. 利用熒光SSR標記構建杏新品系的分子身份證［J］. 北方園藝， 2018（4）： 34-40.

［16］ 王璐偉，沈志軍，李賀歡，等.基于SSR熒光標記的79份桃種質遺傳多樣性分析［J］.中國農業(yè)科學，2022，55（15）：3002-3017.

［17］ IEZZONI A， SCHMIDT H， ALBERTINI A. Cherries （Prunus）［M］. Intl. Soc. Hort. Sci.，Wageningen， The Netherlands，1990.

［18］ CANTINI C，LEZZONI A F，LAMBOY W F， et al. DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats［J］. Journal of the Americal society for horticultural science， 2001，126（2）：205-209.

［19］ BAO W， WU T， LI T， et al. Genetic diversity and population structure of Prunus mira （Koehne） from the Tibet plateau in China and recommended conservation strategies［J］. PLoS ONE， 2017，12（11）： e0188685.

［20］ DIRLEWANGER E， COSSON P， TAVAUD M， et al. Development of microsatellite markers in peach ［Prunus persica （L.） Batsch］ and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry （Prunus avium L.）［J］. Theor Appl Genet， 2002， 105（1）：127-138.

［21］ CIPRIANI G，LOT G， HUANG W G， et al. AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach （Prunus persica L. Batsch） isolation， characterization and cross-species amplification in Prunus［J］. Theor Appl Genet， 1999， 99（1-2）：65-72.

［22］ MASATOSHI N， FUMIO T， YOSHIO T. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data［J］. Journal of molecular evolution， 1983（19）：153-170.

收稿日期：2024-04-16

基金項目：湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2021-620-000-001-01）；湖北省種業(yè)高質量發(fā)展專項資金（HBZY2023A001-52）；湖北省農業(yè)科技重點課題與平臺專項（2021-620-005-003）

作者簡介：葉緣銘（1996-），女，湖北孝感人，研究實習員，碩士，主要從事果樹資源研究，（電話）18772129249（電子信箱）1376148681@qq.com；通信作者，田 瑞（1978-），男，湖北荊門人，副研究員，碩士，主要從事果樹種質資源與遺傳育種研究，（電話）027-87770272（電子信箱）79011129@qq.com；蔡 化，（電子信箱）34582248@qq.com。