禽多殺性巴氏桿菌PlpE基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)

劉永明

摘 ?要 ???多殺性巴氏桿菌是一種重要的人畜共患病的病原菌，有許多不同的血清型，可使多種動(dòng)物感染發(fā)病，其中禽霍亂是其中之一，其主要特征為引起家禽發(fā)生腹瀉、呼吸困難、發(fā)熱等癥狀，此病嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。據(jù)報(bào)道[1]，禽多殺性巴氏桿菌PlpE基因可編碼一種具有較好的交叉免疫保護(hù)性的外膜脂蛋白抗原。本實(shí)驗(yàn)先將目的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)增殖，而后提取細(xì)菌總DNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后運(yùn)用核酸PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增PlpE基因，以確定分離獲得細(xì)菌株是否具有PlpE基因，從而判定該菌致病性的大小，為禽巴氏桿菌病的快速診斷以及奠定初步的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵字 ???多殺性巴氏桿菌，DNA提取，PlpE基因，PCR擴(kuò)增

1. 引言

多年以來(lái)，禽霍亂一直是國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖企業(yè)十分重視的畜禽傳染病，被列為重點(diǎn)防制的家禽疫病之一。由于該病的病程較短、死亡率較高，這給養(yǎng)殖畜禽業(yè)帶來(lái)了極大的危害，造成了巨大的威脅，特別是對(duì)養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)的影響較為嚴(yán)重，現(xiàn)已被人們關(guān)注和重視[5]。目前對(duì)于禽霍亂的主要防制是有弱毒活疫苗和滅活疫苗，弱毒活疫苗有較好的交叉性，交叉的效果較好，但是在接種后的應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)。滅活疫苗有較好的安全性，但是交叉保護(hù)性較差，免疫持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)[8]。禽巴氏桿菌病，又可以稱為禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性的傳染病。禽霍亂的特征主要為發(fā)熱、腹瀉和呼吸困難，最急性病例可以迅速死亡[10]。禽霍亂是可以通過(guò)接觸就能夠傳染的一種疾病，它的發(fā)病率和死亡率都是比較高的，都是能夠危害多種畜禽類，急性敗血的過(guò)程就是禽霍亂的特征表現(xiàn)。出現(xiàn)慢性的疾病或者是局部性的疾病都是要在感染之后或者是急性發(fā)病之后才會(huì)發(fā)生的[11]。由于禽巴氏桿菌病發(fā)病速度比較急和死亡時(shí)間比較快，若是不能及時(shí)的診斷或是治療的話會(huì)引起畜禽的大部分死亡。據(jù)研究報(bào)道，該病原菌在世界各地區(qū)普遍分布，其類型有發(fā)散型或是流行型[6]。一種多殺性巴氏桿菌可以感染多種動(dòng)物及無(wú)宿主特異性，也可以通過(guò)呼吸道進(jìn)行生殖垂直傳播和水平傳播[4]。不同動(dòng)物感染后發(fā)病的狀態(tài)和變化情況都不一樣。

禽巴氏桿菌病的病原菌為多殺性巴氏桿菌[7]，該菌體屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，菌體呈兩極著色，單個(gè)存在，有時(shí)成雙排列，是一種革蘭氏陰性需氧兼性厭氧菌，是球桿狀或者是短桿狀的一種細(xì)菌，該細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)有較高的要求，其兩側(cè)鈍圓，中央則是微微突起的，沒有芽孢的形成也沒有鞭毛，是不運(yùn)動(dòng)的一種菌。關(guān)于巴氏桿菌屬細(xì)菌的報(bào)道已經(jīng)有了20多種，一般存在健康動(dòng)物的咽部黏膜和口腔，是一種條件致病菌。

對(duì)致病性以及在宿主體中存活和繁殖有重要作用的是細(xì)菌毒力因子[13]。而且部分的毒力因子的免疫原性有比較強(qiáng)，所以對(duì)部分的毒力因子進(jìn)行研究并成此病預(yù)防及治療提供了理論依據(jù)。目前確定多殺性巴氏桿菌毒力因子和免疫原主要是有莢膜、外膜蛋白、脂多糖和PMT毒素。莢膜具有細(xì)菌的致病性和粘附性，抗干燥，其中主要的成分是透明質(zhì)酸。莢膜可以用做制備疫苗。其中，脂蛋白E不僅僅是巴氏桿菌的一種膜脂蛋白，其主要作用是具有粘附宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)研究的表明，脂蛋白E也還是一種保護(hù)性抗原的因子[12]。

多殺性巴氏桿菌的分型主要采用血清學(xué)方法檢測(cè)莢膜和菌體抗原[2]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6個(gè)血清群（A、B、C、D、E、F）和16種菌體血清型。許多學(xué)者在研究禽霍亂亞單位疫苗是利用了化學(xué)的方法提取了禽巴氏桿菌莢膜多糖等物質(zhì)，這種方法雖然比較好，但是成本較高，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展利用在大腸桿菌中成功的表達(dá)了禽多殺性巴氏桿菌PlpE蛋白[9]，這種蛋白是巴氏桿菌外膜蛋白的其中一種，其免疫學(xué)活性可能較強(qiáng)。本次實(shí)驗(yàn)的目的是為了探討不同菌株中PlpE基因的存在情況，以期為探討PlpE基因在該菌致病作用、PlpE蛋白對(duì)疾病的免疫效果乃至為PlpE蛋白檢測(cè)提供一定的前期基礎(chǔ)。

2. 材料與試劑

2.1 菌株

禽巴氏桿菌菌株（由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）

2.2 主要器皿、設(shè)備

玻璃棒、平皿、錐形瓶、燒杯、電子天平秤、電爐、100ml量筒、電熱恒溫水浴鍋、自動(dòng)高壓鍋、水平電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺(tái)、試管、離心機(jī)、梯度PCR儀、0.5mLPCR管、各種規(guī)格的吸頭、微波爐、立式高壓蒸汽滅菌器、WJ-3型-160 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、落地式全溫振蕩器、高速冷凍離心機(jī)等

2.3 主要試劑和培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基： 100ml的蒸餾水，營(yíng)養(yǎng)肉湯1.8g，馬血清5ml。

LB固體培養(yǎng)基：1%蛋白胨1g，0.5% 酵母0.5g，1%NaCl1g，1.6g瓊脂粉，NaOH溶液，馬血清5ml，加水到100ml。

試劑：TIANamp Bacteria DAN Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、革蘭氏染色液試劑盒。

3. 方法

3.1禽巴氏桿菌的純化培養(yǎng)

3.1.1 培養(yǎng)基的制備

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：稱量2.2g，放在錐形瓶里，加入100ml的蒸餾水，調(diào)PH至7.0，在電爐上加熱攪拌溶解至透明，利用記號(hào)筆進(jìn)行標(biāo)記，在加塞子之后用牛皮紙將其瓶口包裹好。將制作好的液體培養(yǎng)基錐形瓶放在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高壓15min，待高壓結(jié)束之后，要等到高壓鍋內(nèi)的氣壓放氣完后才能打開，取出錐形瓶置于超凈工作臺(tái)上，冷卻至45℃左右，即可加入馬血清5ml，混勻，然后將混勻好的培養(yǎng)基分別倒入試管內(nèi)（每支試管不超過(guò)1/4），在操作過(guò)程的中要一直保持無(wú)菌的狀態(tài)，以防止被其他細(xì)菌污染。

LB固體培養(yǎng)基：稱量1%胰蛋白胨1g，0.5%酵母0.5g，1%NaCl1g和1.6g的瓊脂粉放置在錐形瓶中，蒸餾水加80ml，攪拌溶解，然后再滴加NaOH，利用NaOH將酸堿度調(diào)成7.0，最后再加蒸餾水到100ml進(jìn)行定容，利用電爐加熱溶解到透明狀，加上塞子之后用牛皮紙將瓶口包裝起來(lái)。將做好的培養(yǎng)基錐形瓶放置在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高壓15min，高壓結(jié)束后，注意要等高壓鍋內(nèi)的氣壓為0時(shí)才能打開，取出錐形瓶放在超凈工作臺(tái)上，冷卻至45℃左右，加入馬血清5ml，然后倒入在培養(yǎng)皿上，操作時(shí)保持無(wú)菌操作。

3.1.2細(xì)菌純化

⑴肉湯培養(yǎng)純化法

利用移液槍將已準(zhǔn)備好的菌種挑出一小部分放置于肉湯中，在落地式全溫振蕩器內(nèi)培養(yǎng)24h，取出搖晃時(shí)在若肉湯中出現(xiàn)渾濁則說(shuō)明培養(yǎng)完成。

⑵連續(xù)劃線法

將準(zhǔn)備好的菌種利用連續(xù)劃線法接種到已經(jīng)做好的培養(yǎng)基上，放置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h，若培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落則說(shuō)明培養(yǎng)完成。

3.2 細(xì)菌純化檢驗(yàn)

3.2.1 革蘭氏染色[3]

（1）制片：用移液槍在營(yíng)養(yǎng)肉湯內(nèi)吸取10μl液體或在培養(yǎng)基內(nèi)挑出一小部分菌加少量的生理鹽水，放在滅菌過(guò)的載玻片上攪拌混合。

（2）干燥：為了使水分快速蒸發(fā)，即可將玻片放在酒精燈上，距離火焰10cm處加熱干燥。

（3）初染：滴加草酸銨結(jié)晶紫，染色1min后水洗。

（4）媒染：將載玻片平放在桌面上滴加碘液后，約1min左右進(jìn)行水洗。

（5）脫色：把載玻片上的水利用吸水紙吸凈，然后再滴上乙醇進(jìn)行脫色，等到30秒之后水洗;或者是可以把乙醇滴滿整個(gè)玻片，靜置到30秒后水洗這樣可以不用浪費(fèi)乙醇。

（6）復(fù)染：在進(jìn)行完脫色之后用吸水紙將玻片上的水吸取干凈，若想快速蒸干水分可以在酒精燈上方微微加熱或者是自然干燥。在水分蒸干后在載玻片中間滴加上番紅染液進(jìn)行復(fù)染，染色到1min左右再進(jìn)行水洗。

（7）干燥：完成上一步后用吸水紙或者是紙巾吸掉載玻片上周圍的水，或者是放在自然條件下干燥，又或者是放在酒精燈的上方烘干。

（8）鏡檢：將載玻片放置于顯微鏡上，利用油鏡查看同時(shí)也要注意其細(xì)胞的形態(tài)和顏色。

3.2.2 生化實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)成液體，利用接種針接種到微生物管中，倒插在泡沫上，擱置在37℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)之后觀察并進(jìn)行記載。

3.3 DNA的提取

將上述培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物做成菌懸液，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行提取。其中具體步驟如下：

（1）菌懸液1.5ml，10000rpm離心1min棄清液。

（2）沉淀中加200μl GA。

（3）加20μlProteinaseK溶液。

（4）加220μl GB 70℃水浴鍋放10min離心除管內(nèi)水珠。

（5）加220μl無(wú)水乙醇離心除管內(nèi)水珠。

（6）得到沉淀或溶液加到吸附柱中，吸附柱放收集管中，12000rpm離心30秒廢液棄去。

（7）加500μl GD， 12000rpm離心30秒倒廢液。

（8）加600μl PW，12000rpm離心30秒倒廢液吸附柱放到收集管內(nèi)。

（9）重復(fù)操作步驟8。

（10）12000rpm離心2min棄去廢液。

（11）加100μl TE室溫放2-5min， 12000rpm離心2min。

3.4 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

3.4.1制膠

瓊脂糖稱取0.24g放到小錐形瓶里，加入30ml的 1×TAE，振蕩使瓊脂糖和電泳緩沖溶液充分溶解，再將小錐形瓶放入到微波爐里使其加熱溶解到透明狀態(tài)。把電泳槽放在平的桌面上，將梳子垂直插放在電泳槽上固定，梳子的下端要和電泳槽保持有1mm的間隙。取出小錐形瓶后等到膠冷卻到60℃左右，在膠液中加入5μl的Goldview染料，加完染料之后要混勻，混勻后要把瓊脂糖倒入膠槽內(nèi)，倒的時(shí)候的速度不應(yīng)太快，否則會(huì)產(chǎn)生氣泡。等待膠完全凝固后拔出梳子，將膠槽小心放入電泳槽里，樣品孔在陰極。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖溶液覆蓋凝膠。

3.4.2 電泳

將5μl的DNA和1μl載樣液利用移液槍吹打混勻之后，再將這混合液加入到倒好膠的槽里，加樣時(shí)一定要注意，在每加完一個(gè)樣的時(shí)候要改換一個(gè)槍頭，避免污染，使其電泳的效果不太好，加樣時(shí)也要避免將膠體刺破。在加完樣之后把電泳槽的蓋子蓋上，接通電源，當(dāng)跑到凝膠的2/3時(shí)即可取出。

3.5 PlpE基因的PCR擴(kuò)增

3.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)所查閱的文獻(xiàn)用Primer premier5.0設(shè)計(jì)出來(lái)的引物預(yù)期產(chǎn)物的大小為1008bp，其引物序列為：

將設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行短時(shí)間的離心，稀釋后放置于-20℃的冰箱中保存（引物儲(chǔ)存濃度為100μmol/L，使用濃度為10μmol/L）。

3.5.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

準(zhǔn)備PCR的反應(yīng)溶液，取0.5mLPCR管，按照下列順序加入各試劑：

4. 結(jié)果

4.1生化試驗(yàn)結(jié)果：

取純化培養(yǎng)的巴氏桿菌的菌株，分別接種生化試驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)其結(jié)果見表1。

經(jīng)對(duì)生化試驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)與多殺性巴氏桿菌的生化特性基本一致，可以初步判定該菌是多殺性巴氏桿菌，

4.2 PlpE基因擴(kuò)增結(jié)果：

在提取出來(lái)的DNA中加入利用Primer premier5.0設(shè)計(jì)出來(lái)的禽巴氏桿菌PlpE基因的引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增之后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可看出擴(kuò)增出來(lái)有明顯清晰的條帶，從條帶上可以看出雜質(zhì)較少并且沒有明顯降解。PlpE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1

5. 分析討論

5.1多殺性巴氏桿菌的血清型是比較復(fù)雜的，它們之間沒有或者是有比較弱的交叉免疫原性，不同血清型其致病性有很大差異，更為關(guān)鍵的是該病的傳播速度也是比較快的，且沒有宿主的特異性，因此，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性（如細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定），與診斷人員的實(shí)驗(yàn)技能有直接關(guān)系，加之血清型不同致病性有很大差異，傳統(tǒng)診斷技術(shù)的可靠性能也比較差，給疾病的快速準(zhǔn)確診斷帶來(lái)較大挑戰(zhàn)，建立準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的診斷方法十分必要。此次實(shí)驗(yàn)我們運(yùn)用了PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行PlpE基因檢測(cè)，目的就是初步探討該診斷方法的可靠性。通過(guò)此次的實(shí)驗(yàn)建立了PlpE的PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物大小為1008bp，通過(guò)條件的優(yōu)化且具有良好的特異性、敏感性，為禽巴氏桿菌的快速檢測(cè)奠定了一定的條件基礎(chǔ)。

5.2試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)受到許多因素的影響，在實(shí)際操作中需要注意的具體因素如下：

（1）在做細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)所有的操作都要在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，這是為了避免細(xì)菌中摻雜其他菌株，以導(dǎo)致影響下一步的實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行;在利用劃線法時(shí)也要小心不要把平板內(nèi)的瓊脂刺破了，會(huì)影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng);染色時(shí)要注意水洗的時(shí)候不要將細(xì)菌沖洗掉了，會(huì)影響細(xì)菌DNA的的提取，防止在顯微鏡下觀察不到細(xì)菌;在進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能用手取藥品，應(yīng)該用藥匙，若有液體灑出要利用抹布擦去。強(qiáng)酸強(qiáng)堿的廢液不能直接倒入水池中，應(yīng)該倒在廢液缸中。過(guò)濾是要做好濾紙，以避免有氣泡產(chǎn)生。試管加熱時(shí)不要集中加熱，也不能將試管對(duì)著人。在硫酸和硝酸等液體弄到身上是要立即使用水洗凈，再利用碳酸鈉液洗。

（2）細(xì)菌基因組DAN的提取是好是壞，主要取決于菌的擴(kuò)大培養(yǎng)是否純化，是否存在其他細(xì)菌，其他細(xì)菌存在的越少，說(shuō)明細(xì)菌越純。而DNA提取的效果也是直接影響PCR擴(kuò)增技術(shù)以及進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。DNA提取的方法有很多種，為了確保之后的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行，在本次實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用了DNA試劑盒來(lái)提取細(xì)菌的DNA，在提取DNA時(shí)為了防止DNA降解，操作時(shí)應(yīng)盡量在低溫下或者是冰塊下進(jìn)行。

（3）PCR擴(kuò)增時(shí)要在一個(gè)沒有DNA污染的干凈的環(huán)境下進(jìn)行，在操作的過(guò)程中都要戴手套，而且所有的試劑都要確保沒有核酸和核酸酶的污染，所有的試劑或者是樣品在準(zhǔn)備的過(guò)程中都要使用一次性的滅菌的瓶子和管子，其他的玻璃器皿在洗干凈之后都要高壓滅菌，做好自我保護(hù)的措施。

6. 結(jié)論

禽多殺性巴氏桿菌是對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)影響較大的病原菌，尤其對(duì)養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)影響十分巨大，如何快速準(zhǔn)確診斷十分必要，通過(guò)建立PCR技術(shù)快速擴(kuò)增檢測(cè)PlpE基因，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)禽巴氏桿菌病的快速診斷，同時(shí)也對(duì)了解細(xì)菌菌株對(duì)動(dòng)物體的危害性和對(duì)疾病的免疫效果有所幫助。

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