?婁底地區(qū)魚類腸道微生物與酶活性的初步研究?

?吳杰奇 曾發(fā)姣 雷平 龔平 胡丹 周映華 曾奧 高書鋒

摘 要：研究采用微生物傳統(tǒng)選擇培養(yǎng)法和比色法對(duì)婁底地區(qū)的草魚、鯽魚、鰱魚和鳙魚4種魚腸道的微生物數(shù)量和酶活性進(jìn)行測(cè)定，以期為婁底地區(qū)魚類疾病的防治、微生物添加劑的使用提供資料。結(jié)果顯示：草魚腸道中真菌、腸球菌和大腸桿菌數(shù)量最多，鯽魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌，而鰱魚和鳙魚腸道內(nèi)不存在優(yōu)勢(shì)菌群;草魚腸道內(nèi)纖維素酶和淀粉酶活性較高，鯽魚腸道內(nèi)蛋白酶和脂肪酶活性較高，鰱魚和鳙魚腸道酶活性表現(xiàn)中規(guī)中矩，纖維素酶和淀粉酶活性低于草魚，蛋白酶和脂肪酶活性低于鯽魚。分析認(rèn)為，在健康狀態(tài)下，魚類腸道微生物數(shù)量和酶活性與其食性存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：淡水魚類;腸道微生物;腸道酶活性;婁底

中圖分類號(hào)：S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）04-0055-03

Preliminary Study on Intestinal Microbial Population and Enzyme Activity of Fish in

Loudi Area

WU Jie-qi1，ZENG Fa-jiao2，LEI Ping2，GONG Ping2，HU Dan2，ZHOU Ying-hua2，

ZENG Ao2，GAO Shu-feng2

（1. Loudi Institute of Aquatic Sciences， Loudi 417000， PRC; 2. Hunan Institute of Microbiology， Changsha， 410009， PRC）

Abstract： In order to provide the data of intestinal microorganism and enzyme activity for the prevention and control of fish diseases and the use of microbial additives in Loudi area， the microbial quantity and enzyme activity in the intestines of Ctenopharyngodon idellain， Carassius auratus， Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis? in Loudi area were determined by traditional microbial selective culture and colorimetry. The results showed that Ctenopharyngodon idellain had the highest number of fungi， Enterococcus and Escherichia coli in the intestine; the dominant bacterium in Carassius auratus intestines was Lactobacillus， however there were no dominant bacteria in Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis. Ctenopharyngodon idellain intestine had higher cellulase and amylase activities， Carassius auratus intestine had higher protease and lipase activities. In Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis intestines， cellulase and amylase activities were lower than in Ctenopharyngodon idellain， and protease and lipase activities were lower than in Carassius auratus. Therefore， in a healthy state， there is a corresponding relationship between the number of fish intestinal microorganisms and enzyme activity and food habit of fish.

Key words： freshwater fish; intestinal microorganism; enzyme activity; Loudi

相比哺乳動(dòng)物而言，魚類腸道內(nèi)微生物種類比較簡(jiǎn)單[1-2]。但是由于魚類自身生理?xiàng)l件的限制，魚類腸道發(fā)育還不夠完全，因此這種情況下，由腸道微生物分泌的各種消化酶以及腸道微生物對(duì)魚類免疫的調(diào)節(jié)功能就顯得尤為重要。腸道正常菌群與魚體及周圍水環(huán)境共同構(gòu)成既相互依賴又相互制約的微生態(tài)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的平衡是維系魚類健康的關(guān)鍵。

魚類腸道微生物受多種因素影響，其中主要因素是魚的種類及棲息水域，其他因素有餌料、發(fā)育階段、水溫及生理狀況等[3]。目前，已有較多關(guān)于淡水養(yǎng)殖魚類微生物組成的報(bào)道。哺乳動(dòng)物腸道微生物普遍以雙歧桿菌和乳酸桿菌為主，與之不同，魚類之間的腸道優(yōu)勢(shì)菌群表現(xiàn)出較大差異，甚至不同區(qū)域同一種魚的腸道優(yōu)勢(shì)菌群也不相同[4-7]。因此，對(duì)魚類腸道微生物的研究應(yīng)該系統(tǒng)化，或者定性至某一固定的養(yǎng)殖條件中進(jìn)行。

池塘集約化養(yǎng)殖周期短、產(chǎn)量高，是當(dāng)前主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式。但該模式的養(yǎng)殖密度高、用餌用藥量大，對(duì)水產(chǎn)品安全和周遭環(huán)境造成較大負(fù)面影響[8]。就目前的情況來看，池塘集約化養(yǎng)殖中魚類腸道正常菌群與魚體及周圍水環(huán)境共同構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)已經(jīng)非常脆弱。因此，對(duì)不同環(huán)境條件中的魚類腸道微生物及酶活性進(jìn)行研究顯得非常必要。筆者分析婁底地區(qū)幾種重要經(jīng)濟(jì)魚類的腸道微生物組成及酶活性，以期為該地區(qū)魚類疾病的防治、微生物添加劑的使用和微生態(tài)育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys nobilis）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）和鯽（Carassius auratus）4種試驗(yàn)魚類均采集于婁底市水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地同一養(yǎng)殖池塘。池塘水深2.0 m，面積1.5 hm2。每天用商業(yè)魚飼料（草魚707系列，海大集團(tuán)） 投喂2次（8：00和15：00）。魚樣采樣時(shí)間為2019年6月25日7：00，水溫27.8℃，pH值6.95，溶氧為3.35 mg/L。在地拉網(wǎng)漁獲物中，每類魚隨機(jī)選擇3尾規(guī)格一致的健康個(gè)體進(jìn)行稱重，其中草魚1.00 kg，鯽魚0.21 kg，鰱魚0.45 kg，鳙魚0.41 kg。隨后立即冰浴，并運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，用丁香酚（1∶10 000） 麻醉，再用無菌水和70%乙醇先后沖洗魚體表面。最后在無菌操作箱內(nèi)，無菌采集所有樣品前腸段內(nèi)容物。各品種腸道內(nèi)容物樣品編號(hào)分別為鰱LC（LC1～LC3）、鳙YC（YC1～YC3）、草魚CC（CC1～CC3）、鯽魚JC（JC1～JC3）。

1.2 微生物選擇培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)基：孟加拉紅瓊脂（虎紅瓊脂）;大腸桿菌：山梨醇麥康凱瓊脂（SMAC）;腸球菌：膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂;乳酸菌：乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）。所有合成培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，按照培養(yǎng)基說明進(jìn)行制作滅菌。

將取得的腸道內(nèi)容物搖勻，進(jìn)行無菌稀釋，分別得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀釋液，然后選擇合適的稀釋度，吸取0.1 mL均勻涂布于各選擇培養(yǎng)基平板上。大腸桿菌和腸球菌35℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，乳酸菌35℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，真菌35℃培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。

1.3 腸道內(nèi)容物酶活性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取腸道內(nèi)容物質(zhì)量，按照1∶9（內(nèi)容物∶生理鹽水）加入預(yù)冷生理鹽水后冰浴勻漿，然后2 000 r/min離心15 min，收集上清液于4℃保存?zhèn)溆谩Ｄc道淀粉酶試劑盒、脂肪酶試劑盒、蛋白酶試劑盒和纖維素酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按照各試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析判別組間的差異顯著程度，顯著水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種魚腸道微生物的種類及數(shù)量

由表1可知，相較于哺乳動(dòng)物腸道，魚類腸道內(nèi)容物中微生物含量非常的低，各類微生物幾乎都比哺乳動(dòng)物低一個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能是魚類腸道進(jìn)化未完全以及魚類是變溫動(dòng)物導(dǎo)致的，微生物在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)生長環(huán)境明顯優(yōu)于魚類腸道。從微生物的種類和數(shù)量來看，不同魚類之間微生物也表現(xiàn)出顯著的差異。草魚腸道中數(shù)量較多的是真菌、腸球菌和大腸桿菌（P<0.05），它們皆為草魚腸道的優(yōu)勢(shì)菌群;鯽魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌（P<0.05），而鰱魚和鳙魚腸道內(nèi)不存在優(yōu)勢(shì)菌群（P≥0.05）。從傳統(tǒng)的益生菌乳酸菌來看，鯽魚>鰱魚>鳙魚>草魚，可知雜食性魚類乳酸菌數(shù)量多于濾食性和草食性魚類;而雜食性魚類真菌數(shù)明顯低于草食性和濾食性魚類。

2.2 不同品種魚腸道酶的活性

由表2可知，不同的魚類之間消化酶活性差異非常明顯。草魚的纖維素酶活性最高（P<0.05），腸道內(nèi)纖維素酶主要由微生物分泌，機(jī)體幾乎不分泌，因此該結(jié)果與草魚腸道內(nèi)能夠分泌纖維素酶的微生物數(shù)量最高的結(jié)果相符合。魚類消化器官能夠分泌淀粉酶，各品種魚類腸道中淀粉酶活性由高到低排列依次為草魚>鯽魚>鳙魚>鰱魚，草魚腸道內(nèi)淀粉酶活性仍是最高（P<0.05）。蛋白酶活性以鯽魚的最高，其次為鳙魚和鰱魚，而草魚的蛋白酶活性最低。脂肪酶活性同樣以鯽魚的最高，草魚的腸道脂肪酶活性最低。

3 結(jié)論與討論

魚類腸道含有大量的微生物和消化酶，這些微生物和酶在魚類的消化吸收和抵御外來致病菌方面起著重要作用。穩(wěn)定的腸道微生態(tài)環(huán)境能夠幫助魚類抵御餌料和水體中病原菌對(duì)腸道黏膜表面的不斷刺激。魚類的食性與其腸道酶活性是相對(duì)應(yīng)的，由研究結(jié)果可知，草食性魚類含有相對(duì)較高的纖維素酶活性和淀粉酶活性，雜食性魚類含有相對(duì)較高的蛋白酶活性和脂肪酶活性，這與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致[9-11]。而濾食性魚類腸道的纖維素酶和淀粉酶活性均低于草食性魚類，蛋白酶和脂肪酶高于草食性魚類、低于雜食性魚類。結(jié)合腸道微生物培養(yǎng)可知，草食性魚類腸道中真菌、腸球菌和大腸桿菌數(shù)量較多，那么這幾類微生物很可能是纖維素酶和淀粉酶的高產(chǎn)菌群。同樣，雜食性魚類乳酸菌含量最高，很可能這種乳酸菌的蛋白酶活性非常高。鰱魚和鳙魚都屬于濾食性魚類，從腸道微生物和酶活性結(jié)果來看，它們?cè)谡婢鷶?shù)、乳酸菌數(shù)、纖維素酶和淀粉酶等方面表現(xiàn)出了一定的差異（P<0.05），其他指標(biāo)均沒有明顯差異（P≥0.05），由此可知，二者在指標(biāo)上還是存在一定的相似性。

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（責(zé)任編輯：成 平）