精液處理前和精子優(yōu)化處理后孵育時(shí)間對(duì)夫精宮腔內(nèi)人工授精臨床結(jié)局的影響

楊志偉，耿亞松，李國(guó)臻，陶林林，鄭波

(邢臺(tái)不孕不育?？漆t(yī)院，邢臺(tái)生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺(tái) 054000)

夫精宮腔內(nèi)人工授精技術(shù)(IUI-AIH)是將丈夫精液在體外經(jīng)過(guò)優(yōu)選處理去除精漿，通過(guò)注入等方法輔助活動(dòng)良好的精子進(jìn)入女性宮腔，促使精卵自然結(jié)合以獲得妊娠生育的輔助生殖技術(shù)[1-2]。對(duì)于治療男性因少精子癥、弱精子癥、液化異常、性功能障礙和生殖器畸形等導(dǎo)致的不育和女性宮頸因素、生殖道畸形及心理因素導(dǎo)致性交不能等引起的不孕，是一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全而應(yīng)用廣泛的一線治療手段[1]。然而，其妊娠率受多種因素制約，目前夫精人工授精的妊娠率只有8%～25%[3]，而且有關(guān)IUI周期妊娠率的主要影響因素尚存爭(zhēng)議。本研究主要探討精液優(yōu)化處理前后精子孵育時(shí)間對(duì)宮腔內(nèi)人工授精妊娠結(jié)局的影響，以期為宮腔內(nèi)人工授精標(biāo)準(zhǔn)流程提供合理的依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2018年10月至2019年3月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心接受AIH-IUI治療的107對(duì)夫婦的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤35周歲，首次行IUI；(2)男性不育因素為少精子癥、弱精子癥、液化異常、性功能障礙、生殖器畸形等；女性不孕因素為宮頸因素、生殖道畸形及心理因素導(dǎo)致性交不能。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵泡未破裂黃素化綜合征者；(2)男女一方患有生殖泌尿系統(tǒng)急性感染或性傳播疾??；(3)一方患有嚴(yán)重的遺傳、軀體疾病或精神心理疾患；(4)優(yōu)化處理后活動(dòng)精子總數(shù)≥10×106個(gè)。

二、研究方法

1.促排卵方案：女方月經(jīng)周期規(guī)律者選擇自然周期排卵；月經(jīng)周期不規(guī)律或者排卵障礙時(shí)采用促排卵周期，促排卵周期月經(jīng)第3～5天給予來(lái)曲唑(伊美舒，浙江海正)口服、肌肉注射尿促性素(樂(lè)寶得，珠海麗珠)或者聯(lián)合用藥，持續(xù)用藥5 d，陰道超聲動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況及子宮內(nèi)膜厚度。觀察卵泡直徑>16 mm或者子宮內(nèi)膜厚度>8 mm時(shí)，使用尿LH試紙(昆明云大生物技術(shù))進(jìn)行定性檢測(cè)。尿LH陽(yáng)性，則抽血進(jìn)行血清激素定量檢測(cè)有無(wú)LH峰。當(dāng)B超顯示卵泡直徑>18 mm、血LH出峰，給予HCG(珠海麗珠)10 000 U 肌肉注射，次日B超檢測(cè)有無(wú)排卵，若無(wú)排卵安排排卵前和排卵后兩次授精，若排卵則安排一次授精。如直徑≥14 mm的優(yōu)勢(shì)卵泡≥3個(gè)，放棄該治療周期或改體外授精胚胎移植周期。

2.精液處理：男方禁欲2～7 d，手淫取精于無(wú)菌容器內(nèi)，室溫液化后進(jìn)行精液常規(guī)檢查。用G-MOPS PLUS(Vitrolife，瑞典)將SpermGrad(Vitrolife，瑞典)稀釋成90%和45%兩種濃度的液體，先用巴斯德吸管在離心管中加入1 ml 45%溶液，在其下層試管底部緩慢加入1 ml的90%溶液，然后在頂層緩慢加入所有精液，300g離心15 min。去上層液，底層精子沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 ml G-MOPS PLUS 中，300g離心5 min，洗滌兩次。收集底層精子轉(zhuǎn)入到0.5 ml G-MOPS PLUS中混勻。鏡檢后室溫孵育，待行人工授精。

3.人工授精：術(shù)前排空膀胱，取膀胱截石位，打開(kāi)無(wú)菌人工授精包，用溫鹽水沖洗外陰，沖洗完畢后，鋪無(wú)菌治療巾于患者雙腿，將溫鹽水倒入小量杯，置窺陰器，清洗陰道及宮頸分泌物，清洗完畢。用1 ml BD注射器抽吸精液約0.5 ml，連接人工授精導(dǎo)管，將導(dǎo)管插入宮腔，緩慢將精液注入宮腔距宮頸6～6.5 cm處，注入完畢后，將人工授精管緩慢撤出。術(shù)后抬高臀部，臥床30 min。當(dāng)日常規(guī)使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國(guó))口服或陰道給藥進(jìn)行黃體支持。

4.分組：精液處理前孵育時(shí)間分為A1(0～15 min)、A2(15～45 min)和A3(>45 min)三組，兩次授精的液化時(shí)間不一致，計(jì)為兩個(gè)周期；記錄精子優(yōu)化處理后孵育時(shí)間分為B1(0～15 min)、B2(15～45 min)和B3(>45 min)三組，兩次授精的孵育時(shí)間不一致，計(jì)為兩個(gè)周期。比較不同分組各組間的臨床妊娠率差異。

5.觀察指標(biāo)：授精后28～35 d B超檢查，見(jiàn)孕囊確定臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/總?cè)斯な诰龜?shù)×100%。參考《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版，精液量、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)(PR)精子百分比和正常形態(tài)精子百分比等正常者診斷為正常精子[4]，正常精子率=診斷正常精子例數(shù)/總?cè)斯な诰龜?shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般資料比較

本研究共納入107對(duì)夫婦(授精次數(shù)共173次)，按臨床妊娠結(jié)局分為妊娠組和非妊娠組。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，妊娠組和非妊娠組女方年齡、原發(fā)不育占比、正常精子率、授精次數(shù)、宮腔注入前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 妊娠組和非妊娠組一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、精液處理前孵育時(shí)間對(duì)IUI-AIH臨床妊娠的影響

精液處理前不同孵育時(shí)間組(A1、A2和A3)的臨床妊娠率分別為16.67%、29.73%和13.85%，其中A2組的臨床妊娠率顯著高于A3組(P<0.05)，較A1組略有增高(P>0.05)；各組間女方年齡、原發(fā)不育占比、正常精子率、宮腔注入PR精子總數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 精液處理前不同孵育時(shí)間對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響比較[(-±s)，n(%)]

注：例數(shù)按授精次數(shù)算。與A1組比較，#P<0.05；與A2組比較，*P<0.05

三、優(yōu)化后精子孵育時(shí)間對(duì)IUI-AIH臨床妊娠的影響

精子優(yōu)化后不同孵育時(shí)間組(B1、B2和B3)的臨床妊娠率分別為18.52%、20.59%和15.91%，B2組的臨床妊娠率相對(duì)其他兩組有增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組間女方年齡、原發(fā)不育占比、正常精子率、宮腔注入PR精子總數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 精子優(yōu)化后不同孵育時(shí)間對(duì)患者臨床妊娠結(jié)局的影響[(-±s)，n(%)]

注：例數(shù)按授精次數(shù)算。與B1組比較，*P<0.05；與B2組比較，#P<0.05

四、相關(guān)因素與IUI臨床妊娠的Logistics回歸分析

納入可能影響臨床妊娠的相關(guān)因素，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，女方年齡、原發(fā)不育占比、正常精子率、授精次數(shù)、宮腔注入PR精子總數(shù)與IUI臨床妊娠率無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但隨著原發(fā)不育占比和正常精子率的增加，IUI臨床妊娠率有增高趨勢(shì)；處理前孵育時(shí)間與IUI臨床妊娠率呈非線性相關(guān)，處理前孵育時(shí)間在15～45 min間(A2組)可顯著提高臨床妊娠率(P<0.05)；優(yōu)化后精子孵育時(shí)間與IUI臨床妊娠率的關(guān)系具有相似的趨勢(shì)，孵育時(shí)間在15～45 min間(B2組)有提高臨床妊娠率的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 影響妊娠因素的Logistic回歸分析

討 論

IUI-AIH是一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全而應(yīng)用廣泛的一線輔助生殖治療手段[5]，由于無(wú)創(chuàng)的操作和極少的配子胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間，優(yōu)先被不孕不育癥夫婦選用。然而，針對(duì)于精液在體外的孵育時(shí)間的規(guī)范鮮有報(bào)道，本研究主要通過(guò)不同孵育時(shí)間臨床結(jié)局的比較和多因素相關(guān)分析闡明精液處理前孵育時(shí)間和優(yōu)化后精子孵育時(shí)間對(duì)IUI-AIH臨床結(jié)局的影響。

通過(guò)對(duì)妊娠組和非妊娠組相關(guān)資料的比較和相關(guān)因素與臨床妊娠的相關(guān)性分析，本研究納入資料的女方年齡、原發(fā)不育占比、正常精子率、授精次數(shù)、宮腔注入前向運(yùn)動(dòng)總數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國(guó)玉蕊等[1]的研究顯示，同一周期行雙次人工授精未提高人均妊娠率，顯著提高了周期妊娠率，兩次人工授精能避免卵母細(xì)胞錯(cuò)過(guò)最佳受精時(shí)間。我們的患者資料均為首次行人工授精，但未顯示兩次人工授精的優(yōu)勢(shì)，可能由于卵母細(xì)胞受精時(shí)間窗維持在12～24 h，射精后精子受精能力也可持續(xù)到48～72 h?？紤]到兩次授精的孵育時(shí)間不一致，記為兩個(gè)周期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

精子隨精漿排出體外后，精漿的微環(huán)境與精子發(fā)生的微環(huán)境有著比較大的差異[6]，可能與精子的成熟相關(guān)。有報(bào)道精漿中血清同型半胱氨酸、INH-B和鋅-α2糖蛋白等多種因子與精子的活性相關(guān)[7-8]。Bjorndahl等[9]發(fā)現(xiàn)精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)在體外可能會(huì)有所不同，這取決于精子在射精后儲(chǔ)存在精液中的消耗鋅條件，因此精漿與精子的共孵育有助益精子成熟。我們發(fā)現(xiàn)較少的處理前孵育時(shí)間不能獲得較好的IUI臨床妊娠結(jié)局，可能是因?yàn)榫踊罨嚓P(guān)物質(zhì)過(guò)早分離、不利于精子活化。但是，射精后孵育時(shí)間的延長(zhǎng)不利于精子存活，反而使受精的有害物質(zhì)逐漸積累。Crha等[10]研究指出精漿中高濃度的Hcy有直接的細(xì)胞毒性，造成內(nèi)膜的損傷，氧化應(yīng)激物質(zhì)(ROS)的過(guò)度產(chǎn)生，轉(zhuǎn)甲基作用受到抑制，甚至出現(xiàn)基因的異常表達(dá)[10-11]，因此過(guò)長(zhǎng)的精液處理前孵育時(shí)間不利于人工授精等輔助生殖技術(shù)獲得較好的妊娠結(jié)局。我們的研究結(jié)果證實(shí)，精液處理前的孵育時(shí)間>45 min組相對(duì)于孵育時(shí)間在15～45 min組具有較差的臨床妊娠結(jié)局。

女性生殖道不同位置具有不同的理化性質(zhì)，精子染色體的解聚過(guò)程與這些理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化緊密相關(guān)[9]，正確的時(shí)間點(diǎn)到達(dá)合適的位置有利于卵母細(xì)胞正常受精。梁嘉穎等[12]的研究指出，精液優(yōu)化處理后過(guò)早和過(guò)晚行人工授精不利于臨床妊娠。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)精子染色體逐漸解聚，精卵孵育60 min后，精子染色體解聚度可從25%增長(zhǎng)為80%，精子染色體解聚度<70%時(shí)不能使卵子正常受精[12-13]。精子表面上吸附著具有氧化酶活性的成分，可以穩(wěn)定精子的各種結(jié)構(gòu)，精子運(yùn)動(dòng)的能量主要來(lái)源于精子中段進(jìn)行的糖酵解產(chǎn)生的三磷酸腺苷(ATP)[10]，隨著精子孵育時(shí)間的增加具有氧化酶活性的成分和ATP會(huì)被大量消耗，不利于受精。此外有研究證實(shí)，頂體反應(yīng)的發(fā)生具有時(shí)間依賴性，體外孵育時(shí)間越長(zhǎng)，頂體反應(yīng)率越高[14-15]。精子在培養(yǎng)液中發(fā)生過(guò)度的自發(fā)頂體反應(yīng)會(huì)影響卵母細(xì)胞正常受精進(jìn)而降低臨床妊娠率，同時(shí)隨著精子體外孵育時(shí)間的增加精子DNA碎片率也會(huì)顯著增加，影響精子的受精能力[16]，因此應(yīng)該避免較長(zhǎng)的精子優(yōu)化處理后的孵育時(shí)間。我們的研究顯示精子優(yōu)化處理后時(shí)間在15～45 min時(shí)沒(méi)有顯著提高宮腔內(nèi)人工授精的臨床妊娠，但精液優(yōu)化處理后精子孵育時(shí)間<15 min和孵育時(shí)間>40 min時(shí)的AIH-IUI 臨床妊娠率有降低的趨勢(shì)。

綜上所述，精液處理前的孵育時(shí)間與宮腔內(nèi)人工授精妊娠結(jié)局顯著相關(guān)，我們建議精液采集后15～45 min內(nèi)開(kāi)始優(yōu)化處理，同時(shí)應(yīng)盡量保證處理后孵育時(shí)間在15～45 min內(nèi)行宮腔內(nèi)人工授精。本研究樣本量較小，有待大樣本量持續(xù)驗(yàn)證，為獲得更加穩(wěn)定的IUI臨床妊娠提供參考。