陰陽室微生物燃料電池對磺胺嘧啶的降解性能及其產(chǎn)物生物毒性

汪素芳, 鄭杰蓉, 趙曉嬋, 李培瑞, 董 靜, 岳秀萍

(太原理工大學環(huán)境科學與工程學院，太原 030024)

磺胺類藥物作為一類人工合成的抗生素，廣泛用于人類醫(yī)療和養(yǎng)殖行業(yè)。目前在天然水體、家庭廢水、藥廠廢水及污水處理廠出水中均可檢測出低濃度的磺胺類藥物[1-2]。已有研究表明，低濃度磺胺類藥物進入水體環(huán)境后，可誘導耐藥菌株的產(chǎn)生且不易被生物降解，使得該類藥物在水體和其他環(huán)境介質(zhì)中富集，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成巨大威脅[3-4]。磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)作為磺胺類藥物的代表，極易在環(huán)境中富集，使耐藥菌株的存活率增大，即微生物抗藥性增強，對人和其他生物疾病的治療造成不利影響[5-7]。因此，SDZ去除技術(shù)以及去除規(guī)律值得深入研究。

目前，處理SDZ的方法主要有物理法，化學法和生物處理法。吳南村等[8]采用Fenton法對污水中SDZ進行高級氧化處理，結(jié)果表明Fenton法對受磺胺類藥物污染的水體具有良好的修復作用，去除率可達到99.8%。但該方法有一定的弊端，當廢水中有機物濃度較高時，H2O2和Fe2+投加量大，操作過程煩瑣，一系列副產(chǎn)物需后續(xù)處理才可得到去除。Ziemiańska等[9]使用TiO2-P25/FeCl3紫外光催化氧化污水中殘余的磺胺類藥物，達到相當明顯的去除效果，但此法的催化劑難以回收，活性成分損失較大以及后續(xù)操作比較復雜，難以進行大規(guī)模的工程運用。與物理、化學方法相比，生物處理法具有設(shè)備簡單、操作方便、投資少、運行費用低、二次污染小等優(yōu)點。但是，由于磺胺類抗生素對生物過程有強烈抑制作用，常規(guī)生物處理方法很難達到理想的去除效果。因此，需要尋找一種新的方法將污水處理與能量回收聯(lián)系起來，從而抵消運營成本。

微生物燃料電池(microbial fuel cell, MFC)是在傳統(tǒng)燃料電池基礎(chǔ)上將其與微生物相結(jié)合，通過電極反應的進行實現(xiàn)廢水的有效處理，同時達到電能回收、降低能耗的目的[10]。Shen等[11]發(fā)現(xiàn)使用MFC去除污水中對硝基苯酚的效果明顯優(yōu)于同等反應條件下的厭氧反應器。該技術(shù)對去除污水中難降解有機污染物在操作性和功能性方面具有一定優(yōu)勢[12]。

本實驗選用陰陽室MFC反應器，首次以石墨氈作為電極材料，SDZ為單一底物馴化功能微生物菌群，檢測微生物馴化過程中底物SDZ的濃度變化及其礦化程度，探討MFC反應體系中微生物對SDZ的降解規(guī)律，通過UPLC-MS/MS測定微生物降解SDZ過程中的主要中間產(chǎn)物并推測其代謝路徑。同時采用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄微生物馴化初期體系中電壓的變化趨勢，通過功率密度考察MFC的產(chǎn)電性能。最后以大腸桿菌作為受試菌體，在周期末對SDZ降解產(chǎn)物進行毒性檢測，從而驗證此工藝在SDZ污水處理工程中的可適用性和有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本實驗采用MFC對污水中SDZ進行降解，反應器為陰陽室反應器，包括陽極室、陰極室、質(zhì)子交換膜和外電路等。該反應器選擇導電性能好，孔隙率高的石墨氈為電極材料，由石墨棒通過外電路將陽極與陰極連接起來形成閉合回路。構(gòu)型示意圖如圖1所示。

圖1 MFC反應器構(gòu)型圖

反應器由有機玻璃制成，陽極室與陰極室的有效體積均為250 mL。陽極室內(nèi)放置SDZ反應液和活性污泥，陰極室內(nèi)為50 mmol/L的鐵氰化鉀溶液。電極材料為直徑3 cm、高度10 cm的柱狀石墨氈，連接外電路的導電材料為直徑4 mm、長20 cm的石墨棒，外電阻為1 000 Ω。外電路用導線與陽極和陰極的石墨棒連接，使整個電路形成閉合回路。MFC在微生物降解SDZ的同時輸出電壓，由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Keithley 2700)收集并在計算機進行記錄，每隔10 min自動記錄一次數(shù)據(jù)。

1.2 MFC中活性污泥的馴化

本實驗活性污泥取自晉中市正陽污水處理廠的污泥濃縮池，該水廠采用SBR污水處理工藝。陽極室內(nèi)活性污泥與反應液的體積比為1∶5，其中反應液為人工模擬SDZ廢水，由一定濃度的SDZ和營養(yǎng)液組成。營養(yǎng)液配比為KCl(0.13 g/L)、NH4Cl(0.31 g/L)、Na2HPO4·12H2O(11.55 g/L)、NaH2PO4·2H2O(2.77 g/L)、Wolfe維生素微量元素液(10 mL/L)、Wolfe礦質(zhì)元素液(10 mL/L)，調(diào)節(jié) pH為7.0。本實驗以開路MFC反應器(厭氧反應器)為對照，兩組各設(shè)三個平行實驗，所測實驗結(jié)果在可接受的誤差范圍(1%)內(nèi)取平均值。微生物馴化周期為15 d。反應器啟動后，前兩個月陽極室內(nèi)SDZ濃度為10 mg/L。為了富集更多與SDZ降解相關(guān)的微生物菌群，每周期更換反應液時將反應器中的一半污泥取出，加入等量新鮮污泥。從微生物馴化第三個月開始，每兩個周期將反應體系中SDZ的濃度提高一個水平，SDZ濃度分別為20、30、40 mg/L。每次更換反應液后，在陽極室注入氮氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境。在每個周期定期采樣，測定SDZ濃度及總有機碳(TOC)。SDZ濃度為40 mg/L時，用UPLC-MS/MS檢測中間產(chǎn)物，并在周期末對SDZ代謝產(chǎn)物進行生物毒性檢測。

1.3 分析方法

1.3.1 SDZ濃度及TOC測定

首先對實驗所用SDZ(Sigma-Aldrish,99.8%)藥品進行檢測，使用液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity II, RSD <1%)測得本SDZ藥品的加樣回收率為99.1%，因此以下所測結(jié)果具有一定的可信度。其次，用孔徑為0.22 μm的有機濾膜對樣品進行過濾后，用高效液相色譜儀測定樣品中SDZ濃度，流動相為乙腈和甲酸水(5‰)，體積比為2∶8，流速為1 mL/min，SDZ檢測波長為270 nm。用0.45 μm的無機膜過濾樣品，由TOC分析儀(TOC-V CPH，島津公司，RSD <1%)測定總有機碳(TOC)和無機碳(IC)。

1.3.2 中間產(chǎn)物的測定

以甲酸水(5‰)(A)為水相，乙腈(B)為有機相，采用UPLC-MS/MS對SDZ代謝產(chǎn)物的樣品進行分析。流動相比例梯度為: 0～4 min: A%∶B%=80∶20; 5～7 min: A%∶B%=60∶40; 8～9 min: A%:B%=80∶20。PDA檢測采用200～360 nm波長的連續(xù)掃描。MS/MS分析使用電噴霧電離(ESI+和ESI-)在50～500 m/z的質(zhì)量掃描范圍內(nèi)進行。

1.3.3 產(chǎn)物生物毒性檢測

為驗證MFC反應體系降解SDZ后，其出水是否對人體健康造成安全隱患，本實驗以大腸桿菌為受試菌體，在周期末對SDZ降解產(chǎn)物進行了毒性檢測，步驟如下：①樣品的準備：從反應器中取出周期末反應液，在高速離心機中離心(8 000 r/min，20 min)后，用直徑為0.22 μm的有機濾膜過濾；②大腸桿菌的培養(yǎng)：從-80 ℃冰箱拿出純大腸桿菌，在0 ℃以下的環(huán)境中放置30 min，接種到經(jīng)過高壓滅菌后的LB培養(yǎng)基中進行擴培，直到大腸桿菌進入對數(shù)增殖期進入下一步試驗；③在分別裝有8 mL反應器出水樣品(實驗組)、超純水(空白組)、10 mg/L SDZ溶液(對照組)的離心管中各接種0.5 mL擴培的大腸桿菌菌液，然后加入1.5 mL高濃度LB培養(yǎng)基使得離心管中LB培養(yǎng)基為正常濃度，最后在恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)放置24 h后測定OD600值。

1.3.4 MFC產(chǎn)電性能

為考察以石墨氈為電極材料時MFC的產(chǎn)電性能，在反應體系中加入200 mg/L乙酸鈉和30 mg/L SDZ(使得配水中COD更接近實際藥廠廢水)，測定MFC反應體系的功率曲線和極化曲線。在反應周期中電壓值最大時，改變MFC外電路的電阻值(Rext)，得到不同電阻條件下的電壓及電流(由I=E/Rext可得)，其中Rext分別為10、50、100、200、500、700、1 000、2 000、3 000、5 000、7 000、10 000 Ω。電流密度由電流除以石墨氈橫截面積可得。根據(jù)P=E2/R和P=I2R(其中I為電流)可得各個電流密下的功率密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物馴化初期MFC的電壓變化

MFC反應器啟動后，微生物馴化初期的電壓數(shù)據(jù)如圖2所示。由每個周期的電壓變化趨勢可得，在反應初期，MFC系統(tǒng)中的電壓快速升高，20 h左右即可達到最大值。之后體系中的電壓在總體上呈緩慢下降的趨勢，并伴隨微小的起伏波動，為MFC在降解SDZ的過程中出現(xiàn)的氧化還原峰，最終系統(tǒng)中電壓穩(wěn)定在0.2 V左右。

圖2 微生物馴化期MFC電壓

從四個周期電壓變化的整體趨勢來看，隨著微生物培養(yǎng)時間的延長，每個周期的最大電壓逐漸變小，馴化初期體系中的最大電壓約為0.8 V，到第四個周期減少到0.45 V。這是由于體系中的SDZ對部分微生物的生長具有一定的抑制作用，使得反應體系中微生物活性降低。在微生物馴化過程中，體系中能夠降解SDZ的微生物菌群不斷繁殖累積，而不能適應SDZ環(huán)境的微生物在逐漸衰亡淘汰，從而達到SDZ降解功能菌群馴化的目的。

2.2 MFC的產(chǎn)電性能

改變MFC兩端電阻，得到不同Rext下的電壓值。如圖3所示，Rext<1 000 Ω時，隨著Rext的增大，MFC兩端的電壓快速增大，Rext=1 000 Ω時，電壓值為0.604 V；Rext>1 000 Ω時，隨著Rext的增大，MFC兩端的電壓緩慢增加并趨于平穩(wěn)。當Rext增加到10 000 Ω時，MFC兩端電壓為0.676 V。

圖3 MFC中不同外阻條件下的電壓值

此外，本實驗通過測定極化曲線，表征在一定電流條件下MFC可得到的最大電壓。由于MFC受特定微生物菌群的限制，隨著Rext的增大，在系統(tǒng)中有一個最大電壓OCV。如圖4所示，電流密度接近零(Rext為無窮大)時，MFC兩端的電壓最大，OCV為0.698 V。從功率曲線可以看出，隨著電流密度的增大，功率密度先增大后減小，呈“單峰型”，當電流密度為0.139 mA/cm2時，系統(tǒng)中功率密度是678 mW/m2，為最大功率密度。該實驗中MFC功率密度高于其他碳電極材料(如碳刷、碳布等)的MFC[13]。由此可見，以石墨氈為電極材料時，MFC具有良好的產(chǎn)電性能。

圖4 極化曲線和功率曲線

圖5 MFC反應器對SDZ的去除效果

2.3 MFC對不同濃度SDZ的降解規(guī)律

MFC啟動完成后，測定各個周期SDZ的濃度變化。MFC反應體系中微生物對不同濃度SDZ的降解規(guī)律如圖5所示。在微生物馴化第三個月時，反應器中SDZ初始濃度為20 mg/L。反應7 d后，厭氧反應器中SDZ濃度為6.58 mg/L，去除率為67.09%；MFC反應器中SDZ濃度為4.01 mg/L，去除率為79.97%。由此可見，SDZ初始濃度為20 mg/L時，MFC反應器在一定程度上促進反應體系中SDZ的降解。在微生物馴化第四個月時，反應器中SDZ初始濃度為30 mg/L，反應7 d后，厭氧反應器和MFC反應器中SDZ濃度分別為0.65 mg/L和1.18 mg/L，去除率分別為97.83%和96.07%，兩種反應器對SDZ的降解效果沒有顯著差異。在微生物馴化第五個月時，反應器中SDZ的初始濃度提高到40 mg/L，反應7 d后，厭氧反應器中SDZ去除率為84.19%；MFC反應器中SDZ的去除率為98.23%，比厭氧反應器對SDZ的降解率超出14.04%。因此，在不同濃度水平下，與厭氧反應器相比，MFC反應器對SDZ的降解具有一定的優(yōu)勢。

從同一組反應器不同SDZ初始濃度的降解趨勢來看，SDZ初始濃度為20 mg/L時，反應初期體系中SDZ濃度急劇減少。對于MFC反應器，反應2 d后體系中微生物對SDZ去除率可達49.37%，之后微生物對SDZ的降解速度減緩，5 d內(nèi)僅降解30.60%；對于厭氧反應器，反應開始1 d后，體系中微生物對SDZ降解率可達53.73%，之后6 d內(nèi)微生物對SDZ僅降解13.36%。這種降解趨勢很大程度上與反應器中微生物所依附的體系有關(guān)。該反應體系中大量微生物附著在活性污泥和石墨氈表面，而活性污泥和石墨氈對有機物也有一定的吸附性。因此，在厭氧和MFC反應體系中，在反應初期大量SDZ吸附于活性污泥和石墨氈的表面，表現(xiàn)出SDZ濃度迅速降低。但這并不是真正的去除，而是體系中生物吸附和物理吸附共同作用的結(jié)果。經(jīng)過一段時間后，這些被吸附于活性污泥和石墨氈表面的SDZ會有一部分脫附，體系中SDZ的濃度有所回升，如圖5所示。在上述初期吸附完成后，吸附在活性污泥表面的SDZ會逐漸與生物細胞接觸，進入細胞體內(nèi)被微生物降解，使得SDZ得到真正的去除。當SDZ初始濃度為40 mg/L時，整個反應周期內(nèi)反應體系中微生物對SDZ的降解速率基本不變，可能是由于微生物對SDZ的吸附和降解達到平衡?？梢婋S著功能菌群的馴化，反應體系中微生物對SDZ的降解趨于穩(wěn)定，表明反應器中的功能菌群馴化成熟。

本實驗還測定了不同SDZ濃度條件下TOC的降解率來評價反應體系中SDZ的礦化程度，如圖6所示。隨著SDZ濃度的增大，厭氧和MFC反應體系中的微生物對TOC的去除效果越好，說明隨著微生物的馴化，反應體系對SDZ的礦化程度越大。同時，MFC反應器對TOC的去除率整體上明顯高于厭氧反應器。SDZ的初始濃度為40 mg/L時MFC體系中TOC的去除率可達65.13%，而厭氧反應器僅有51.14%，MFC反應器體現(xiàn)出更好的礦化性能。

總而言之，反應體系中SDZ的初始濃度在各個水平時，反應開始7 d后MFC對SDZ和TOC的去除效率均高于厭氧反應器，由此可見以石墨氈為電極材料的MFC反應器對SDZ和TOC的去除有良好的效果。

圖6 TOC的去除率

2.4 MFC降解路徑推測

實驗根據(jù)所測得的主要中間產(chǎn)物，推測了兩種SDZ降解路徑，如圖7所示。本實驗中，SDZ在微生物反應體系中的降解主要包括SDZ水解，硫還原，C—N鍵斷裂等反應。SDZ是由嘧啶部分和磺胺部分構(gòu)成，連接磺胺部分和嘧啶部分的N—H鍵被水解后生成對氨基苯磺酸(P3)。之后體系中微生物代謝SDZ的一條主要路徑是磺胺部分硫的還原，第一步硫還原生成對氨基苯亞磺酸(P4)，再脫氨基生成苯亞磺酸(P5)，最終P7脫落，形成苯環(huán)(P6)開環(huán)后被微生物降解。

圖7 SDZ降解路徑

由于反應體系中存在硫酸根離子，研究表明硫酸根離子作用于嘧啶環(huán)的C—N鍵，可形成P2,同時N—S鍵斷裂，生成對氨基苯亞磺酸[14]，該降解路徑在本實驗中也得到了證實。

圖8 空白組、對照組、實驗組OD600值對比

2.5 出水生物毒性檢測

本實驗對普通的LB培養(yǎng)基(空白組)，含有10 mg/L SDZ的LB培養(yǎng)基(對照組)，以及用初始SDZ為40 mg/L的MFC周期末反應液配制的LB培養(yǎng)基(實驗組)進行了實驗，每組均設(shè)置三個平行實驗,所測結(jié)果在可接受的誤差范圍內(nèi)(1%)取平均值。如圖8所示，實驗結(jié)果表明，含有SDZ的LB培養(yǎng)基(對照組)在培養(yǎng)大腸桿菌24 h后，OD600值明顯低于空白組和實驗組，而含有周期末反應液的LB培養(yǎng)基(實驗組)與普通LB培養(yǎng)基(空白組)的OD600值基本一致。由此可見，LB培養(yǎng)基中的SDZ對大腸桿菌的生長具有一定的抑制作用，而MFC周期末反應產(chǎn)物對大腸桿菌的生長并無抑制作用。因此使用以石墨氈為電極材料的MFC降解污水中的SDZ無生物毒性，屬于綠色環(huán)保的污水處理工藝，可用于實際污水處理過程。

3 結(jié)論

首次以石墨氈為電極材料，采用陰陽室微生物燃料電池處理污水中的SDZ，主要性能表現(xiàn)如下。

(1)最優(yōu)初始條件：當微生物馴化第五個月時，反應器中 SDZ初始濃度為40 mg/L，MFC反應器對SDZ的去除效果最好，此時微生物已馴化成熟。

(2)實驗結(jié)果和應用優(yōu)勢：SDZ初始濃度為40 mg/L時，MFC對SDZ的去除在7 d內(nèi)可達98.23%，且優(yōu)于厭氧反應器，體現(xiàn)出良好的降解性能; MFC反應器對SDZ的礦化率在第7 d可達到65.13%，明顯高于厭氧反應器，體現(xiàn)出良好的礦化性能; 以石墨氈為電極材料的MFC體系中最大功率密度為678 mW/m2，最大電壓OCV為0.698 V，具有良好的產(chǎn)電性能; 產(chǎn)物生物毒性檢測結(jié)果表明 MFC反應器出水無生物毒性，因而該技術(shù)為一項綠色、環(huán)保的技術(shù)。

(3)反應過程與機制：MFC反應體系中的微生物降解SDZ主要有兩條路徑，包括SDZ水解，磺胺部分硫的還原，嘧啶部分C—N鍵的斷裂等化學反應，表明反應體系中具有不同功能的微生物菌群共同作用，通過MFC加快電子轉(zhuǎn)移效率，從而促進污水中SDZ的生物降解。

4 展望

使用MFC降解廢水中的SDZ，是一種高效環(huán)保的微生物技術(shù)。從本研究的角度來看，對傳統(tǒng)MFC降解SDZ的代謝機理和功能微生物菌群的豐度和地位進行深入研究，可為污水處理廠的實際應用提供一定的理論基礎(chǔ)。從宏觀的角度來看，將MFC對SDZ的降解引申為對多種抗生素的降解，同時通過對MFC反應器結(jié)構(gòu)和電極材料進行改造，在提高底物降解效率的同時，進一步提高反應器的產(chǎn)電性能，從而實現(xiàn)污水處理的資源化，并將其應用于實際藥廠廢水的治理，同樣具有非常廣闊的發(fā)展前景。