多房棘球絳蟲重組抗原蛋白14-3-3對小鼠繼發(fā)性泡球蚴病的預(yù)防與治療效果#

魏 威，王 蕾，周 培，張 穎，李潤樂&，湯 鋒

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016)

14-3-3蛋白是眾多真核生物中高度保守并廣泛表達的酸性蛋白家族成員[1，2]。在不同的生長階段都可檢測到穩(wěn)定存在的14-3-3蛋白并發(fā)現(xiàn)其在多房棘球絳蟲(E.multilocularis)的增殖、分化等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-5]。本課題評價了重組抗原蛋白14-3-3的免疫原性和其在多房棘球絳蟲原頭節(jié)繼發(fā)性感染小鼠模型中的預(yù)防及治療效果。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

pCzn1載體(南京，鐘鼎生物)；TOP 10感受態(tài)細胞、BL-21感受態(tài)細胞(北京，天根生化)；質(zhì)粒提取試劑盒(上海，生工)；鎳離子親和層析介質(zhì)(南京，金斯瑞)；Elisa抗體(英國，Abcam)；細胞因子IL-4、IFN-γ檢測試劑盒(瑞典，Mabtech)。

1.1.2 實驗動物

36只5～7周齡雄性BALB/c小鼠(北京，斯貝福)，動物合格證號：SCXK9(京)2019-0010；對實驗動物的日常護理及實驗操作均遵循NIH實驗室動物護理和使用指南。

動物使用方案通過了青海大學(xué)動物倫理與實驗委員會的審核(QHDX 2018 09)。

1.2 實驗方法

1.2.1 pCzn1-14-3-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

從GenBank中獲得14-3-3的氨基酸序列(GenBank ID：CDS36536.1)，經(jīng)OptimumTMCodon軟件優(yōu)化得到適合原核表達的堿基序列，引入NdeI和XbaI限制性內(nèi)切酶位點并克隆入載體pCzn1中，通過NdeI和XbaI雙酶切驗證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.2 重組蛋白14-3-3的表達及純化

重組蛋白14-3-3的誘導(dǎo)表達參照Li等[6]的方法。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并確定重組蛋白表達部位后，通過鎳離子親和層析法純化14-3-3蛋白，以40、35、30、25、20 mM咪唑分別洗脫雜蛋白，之后使用200 mM咪唑洗脫目的蛋白并收集。

1.2.3 小鼠免疫與感染

將12只小鼠分為兩組，分別用50 μg/只的14-3-3抗原蛋白和PBS免疫(4次，間隔1周)，第一次免疫加入等量的完全弗氏佐劑，而第二、三次免疫加等量的不完全弗氏佐劑，末次免疫不加佐劑。最后一次免疫完成后(7天)取血清(4000rpm/min)并保存在-80 ℃冰箱。

原頭節(jié)的分離：參照文獻方法[6]。脫頸處死多房棘球蚴感染的保種沙鼠，從沙鼠腹腔分離囊泡后剪碎并依次經(jīng)45目和150目篩網(wǎng)分離得到多房棘球蚴原頭節(jié)。

預(yù)防評價模型的建立：參照文獻方法[7]。每組6只的兩組小鼠免疫接種14-3-3抗原蛋白(實驗組)或PBS(對照組)，共進行4次(間隔一周)。最后一次免疫接種后兩周時向腹腔內(nèi)注射原頭節(jié)(1000個)，感染4個月后采集小鼠血清并處死小鼠，對其囊泡進行計數(shù)與稱重。

治療評價模型的建立：參照文獻方法[6]。向兩組小鼠(每組6只)腹腔注射原頭節(jié)(1000個)，感染4個月后每隔1個月腹腔注射含等量完全弗氏佐劑的重組14-3-3蛋白(50μg/只)或PBS(50μg/只)，共進行4次。末次免疫后兩周，采集血清后處死小鼠并對其囊泡進行計數(shù)與稱重。

1.2.4 特異性抗體檢測

1.2.5 細胞因子檢測

血清IFN-γ、IL-4的分泌水平通過ELISA法測定，具體的操作按試劑盒說明進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒14-3-3的構(gòu)建及酶切鑒定結(jié)果

pCzn1-14-3-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜如圖1所示；重組質(zhì)粒酶切鑒定顯示目的條帶與14-3-3標準序列長度一致，表明pCzn1-14-3-3目的序列已成功插入載體中，如圖2所示。

圖1 pCzn1-14-3-3重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖

Line1：酶切前質(zhì)粒；Line2：酶切后質(zhì)粒.酶切位點：NdeI-XhoI

2.2 重組蛋白14-3-3的表達與純化結(jié)果

分別收集14-3-3蛋白原核表達中的菌液及沉淀進行凝膠電泳，重組蛋白在28 KD處形成明顯條帶，并且主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖3A)。14-3-3蛋白包涵體經(jīng)過變、復(fù)性處理后，通過Ni-IDA親和層析法純化14-3-3蛋白，以40 mM的咪唑洗去雜蛋白后得到的蛋白的純度最高(圖3B)。

A.原核表達的12%SDS-PAGE分析圖；B.重組蛋白14-3-3的純化圖

2.3 重組14-3-3蛋白免疫后特異性抗體和細胞因子檢測結(jié)果

采用間接ELISA法評價14-3-3對小鼠的特異性抗體誘導(dǎo)能力。與PBS免疫組相比，14-3-3免疫能顯著增加特定的免疫球蛋白的分泌水平。小鼠血清抗14-3-3的抗體中除IgE與PBS免疫小鼠相比無差異(P>0.05)外，IgG1、IgG2a、IgG、IgM和IgA的抗體水平與PBS免疫小鼠相比都明顯升高(P<0.05)(表1)；通過ELISA法檢測了小鼠血清中IFN-γ和IL-4的水平。與PBS免疫小鼠和正常對照組(NC)相比，14-3-3免疫小鼠IFN-γ細胞因子濃度顯著升高(vs.PBS：P=0.004；vs.control：P=0.001；F=54.731)；IL-4的分泌水平(vs.PBS：P=0.764；vs.control：P=0.370；F=1.715)在免疫后無明顯升高(表2)。

表1 重組14-3-3蛋白免疫后小鼠特異性抗體檢測結(jié)果

表2 重組14-3-3蛋白免疫后小鼠細胞因子檢測結(jié)果

2.4 重組14-3-3蛋白的預(yù)防作用

14-3-3的預(yù)防效果通過檢測囊泡的數(shù)量和重量來評估。14-3-3與PBS免疫小鼠的囊泡數(shù)量、重量差異顯著，分別減少了59.84±15.09%(P<0.05)和83.28±18.01%(P<0.001)(圖4、表3)。IgG1、IgG2a、IgG、IgM、IgA都較PBS組顯著升高(P<0.05)；IgE的水平與對照組相比無明顯增高(P>0.05)(表4)；小鼠血清的IFN-γ(vs.PBS：P=0.000；vs.control：P=0.000；F=621.968)、IL-4(vs.PBS：P=0.002；vs.control：P=0.000；F=19.430)水平顯著增高(表5)，提示重組14-3-3蛋白對E.multilocularis所致的泡球蚴病(Alveolar Echinococcosis，AE)有較好的預(yù)防作用。

圖4 囊泡的大小和數(shù)量

表3 預(yù)防性免疫后重組14-3-3蛋白對囊泡數(shù)量和囊泡重量的影響結(jié)果

表4 預(yù)防性免疫后的特異性抗體水平

表5 預(yù)防性免疫后IFN-γ和IL-4水平

2.5 重組14-3-3蛋白的治療作用

14-3-3的治療效果的評估方法與預(yù)防性研究方法相同。14-3-3與PBS治療小鼠的效果在囊泡數(shù)量上沒有差異(P>0.05)，在囊泡重量上減少了(P<0.05。72.28±11.47%。圖5，表6)。在治療組中，血清IgG1、IgG2a、IgG、IgM、IgA顯著升高(P<0.05)；IgE的水平與對照組相比無明顯增高(P>0.05。表7)；小鼠血清IFN-γ(vs.PBS：P=0.000；vs.control：P=0.000；F=129.171)、IL-4(vs.PBS：P=0.003；vs.control：P=0.000；F=57.053)水平顯著增高(表8)，提示重組14-3-3蛋白對E.multilocularis所致的AE有良好的治療作用。

圖5 囊泡的大小和數(shù)量

表6 治療性免疫后重組14-3-3蛋白對囊泡數(shù)量和囊泡重量的影響結(jié)果

表7 治療性免疫后的特異性抗體水平

表8 治療性免疫后的IFN-γ和IL-4水平

3.討論

AE被認為是對人類最為致命的寄生蟲病之一，這種被忽視的人畜共患病呈現(xiàn)發(fā)展態(tài)勢，在不受干預(yù)的情況下十年內(nèi)超過九成的患者死亡[8]。近20年來，該病在全球的流行規(guī)模顯著擴大。歐洲流行范圍向東部和北部擴展，亞洲多地也是受影響區(qū)域，日本、中國等地都有相關(guān)報道[9]。對于這種有著嚴重危害的疾病，阿苯達唑或甲苯咪唑化療是AE的藥物治療方法，但此藥物長期使用所產(chǎn)生的副作用影響了療效。

14-3-3蛋白與寄生蟲的生長有著密切關(guān)系，所以針對多種病原生物14-3-3蛋白的研究已經(jīng)展開了。Li等[10]發(fā)現(xiàn)在犬新孢子蟲中該蛋白可以激活多種信號通路而引起機體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，提示其可作為一種新的抗新孢子蟲病候選疫苗。李文桂等[11]以該蛋白作為疫苗對其是否可以在小鼠中產(chǎn)生有效的保護作用進行研究，實驗結(jié)果顯示14-3-3可抑制棘球蚴生長，產(chǎn)生了較強的保護力。為探究14-3-3蛋白在人類和非人靈長類動物中的保護作用，Lampe等[12]以明礬作為佐劑的重組抗原14-3-3免疫恒河猴，證實了這種蛋白的免疫保護在非人靈長類動物中也是安全有效的。在多房棘球絳蟲中，14-3-3表現(xiàn)出了更加多樣的功能，它的多個亞型在生活史的各個階段可根據(jù)不同需求差異性表達[13，14]。14-3-3蛋白參與了寄生蟲關(guān)鍵的細胞生命活動，進一步探究該蛋白對宿主免疫系統(tǒng)和寄生蟲生長發(fā)育的影響將有助于發(fā)現(xiàn)它的作用機制。

寄生蟲感染通常導(dǎo)致白細胞中嗜酸性粒細胞的增加，這一群體的細胞具有限制寄生蟲生長的功能，發(fā)揮作用的抗體包括IgG、IgM、IgE和IgA。14-3-3蛋白誘導(dǎo)了高水平的特異性免疫球蛋白，但血清特異性IgE抗體沒有顯著增加，這可能與寄生蟲特異性T細胞產(chǎn)生的IL-4和IFN-γ的相對量增加有關(guān)，而其中IFN-γ可抑制寄生蟲抗原所誘導(dǎo)的IgE產(chǎn)生[15，16]。在AE的感染過程中，免疫應(yīng)答可分為三個明顯的階段：早期為Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答，中期則是以Th2型免疫應(yīng)答為主導(dǎo)，在感染的最后階段出現(xiàn)T細胞耗竭狀態(tài)[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白作為預(yù)防和治療的疫苗，可以使感染多房棘球絳蟲小鼠的IFN-γ和IL-4顯著增加，引發(fā)了Th1-Th2混合免疫反應(yīng)。在感染多房棘球絳蟲后，小鼠肝臟NK細胞數(shù)量減少，這可能通過降低IFN-γ的分泌而限制其細胞毒活性，并使得被感染小鼠肝臟的免疫耐受能力受到影響[18]，而14-3-3蛋白使多房棘球蚴感染后小鼠體內(nèi)的寄生蟲囊泡重量明顯降低的結(jié)果或許與免疫佐劑所誘導(dǎo)的IFN-γ水平顯著增高有關(guān)。

本課題成功構(gòu)建了多房棘球絳蟲抗原14-3-3蛋白的原核表達系統(tǒng)并分離純化了高純度的14-3-3重組蛋白，對其所產(chǎn)生的免疫預(yù)防和治療作用進行了研究，這對后續(xù)探究14-3-3蛋白在寄生蟲感染等領(lǐng)域中的生物學(xué)作用提供了依據(jù)。