乳鐵蛋白對(duì)高海拔雄性小鼠急性放射性腸損傷的作用※

王 冰，陳 凡，馮瑞興，殷 麟，楊 美，孫祥益

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，青海 西寧 810000)

放射腸道損傷嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)腸壞死、腸穿孔，甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。目前臨床上對(duì)放射性腸損傷尚無(wú)理想的防治手段[2]。

乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)有抗氧化、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)功能[3]。有研究認(rèn)為，LF還具有一定抗輻射損傷的作用[4]，但其對(duì)放射性腸損傷是否有影響目前尚無(wú)定論，高海拔下為何種情況尚無(wú)報(bào)道。本研究在建立小鼠放射性腸損傷模型的基礎(chǔ)上，探討LF對(duì)高海拔雄性小鼠急性放射性腸損傷的作用。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇及飼養(yǎng)

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重(20±2)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。在青海大學(xué)基礎(chǔ)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度18 ℃～22 ℃，濕度50%～70%。實(shí)驗(yàn)期間予小鼠自主飲食(普通小鼠維持飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司)飲水。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格遵守有關(guān)國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理的政策法規(guī)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利原則。

1.2 主要試劑與儀器選擇

牛乳提取乳鐵蛋白(批號(hào)：146897-68-9，含量95%，上海源葉生物科技有限公司)；小鼠丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、二氨氧化酶(DAO)、一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)Elisa檢測(cè)試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)；23EX醫(yī)用電子直線加速器(美國(guó)Varian醫(yī)療系統(tǒng)公司)；臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏設(shè)備公司)；包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器)；切片機(jī)(德國(guó)LEICA)；水浴鍋(江蘇榮華公司)；顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.3 藥物預(yù)處理

取LF溶于生理鹽水，按比例分別配置濃度為20、40、60 mg/mL的LF溶液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每次用前搖晃均勻，并待其恢復(fù)到室溫后再行灌胃。

1.4 分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)第7 d時(shí)，觀察小鼠有無(wú)不良反應(yīng)，進(jìn)食飲水活動(dòng)是否正常。將50只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、2 mg LF+照射組、4 mg LF+照射組、6 mg LF+照射組(每組10只)。LF各組每天通過(guò)灌胃的方式給予相應(yīng)劑量的藥物，正常對(duì)照組及單純照射組以同樣方式予0.1 mL生理鹽水連續(xù)灌胃10 d，于第7 d對(duì)各照射組小鼠進(jìn)行照射。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水。

1.5 放射性腸損傷模型的建立

灌胃第7 d起將小鼠禁食12 h，不禁水，之后用5%水合氯醛行腹腔注射麻醉，將各照射組小鼠固定在特制固定板上，參照文獻(xiàn)[5]予以小鼠23 EX醫(yī)用直線加速器單次腹部14 Gy劑量照射， 劑量率為400 cGy/min，照射范圍為劍突至恥骨聯(lián)合， 照射面積為2.0×2.0 cm，源皮距(SSD)為100 cm。照射完畢待小鼠蘇醒后將其放回籠內(nèi)。

1.6 檢測(cè)

1.6.1 一般情況：觀察小鼠飲食、活動(dòng)狀態(tài)，胃腸道癥狀(糞便性狀及頻率)以及體重變化。

1.6.2 腸黏膜組織病理形態(tài)變化情況：參照文獻(xiàn)[5，6]于照射后第3 d行5%水合氯醛腹腔麻醉，處死小鼠后迅速打開腹腔，取2 cm空腸組織，用10%甲醛液固定24 h，行常規(guī)包埋、切片、染色，置光鏡下觀察小腸黏膜及絨毛組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.6.3 血漿DAO、TGF-β的測(cè)定方法：照射后第3 d起禁食12 h后用5%水合氯醛麻醉小鼠，在無(wú)菌狀態(tài)下從眼球取血，加入肝素抗凝，離心(4℃，2500r/min)10 min，取上層血漿置-80 ℃冰箱保存。按照Elisa試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血漿DAO、TGF-β的含量。

1.6.4 小腸組織勻漿MDA、SOD、NO的測(cè)定方法：取小鼠空腸組織2 cm，將腸組織放入液氮后研磨，加入Ripa裂解液裂解，離心(4℃，4000r/min)4 min(r=7cm)，取上清液置4 ℃冰箱保存，分別按照MDA、SOD及NO Elisa試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MDA、SOD及NO含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

照射后24 h各組均未見明顯異常，較照前無(wú)明顯改變。照射后48 h單純照射組小鼠均出現(xiàn)稀水樣便，無(wú)黏液樣便和血便，精神較之前萎靡，行動(dòng)稍遲緩，飲食差；2 mg LF+照射組1只小鼠出現(xiàn)稀水樣便，精神尚可，飲食正常。照射后72 h單純照射組有4只小鼠有黏液樣便，無(wú)血便；2 mg LF+照射組有3只小鼠出現(xiàn)稀水樣便，無(wú)黏液樣便和血便，精神稍萎靡，飲食欠佳，其他小鼠無(wú)明顯胃腸道癥狀，未見死亡。與正常對(duì)照組比，單純照射組小鼠體重明顯減輕(P<0.01)；與單純照射組比，LF各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組小鼠照射后第3天體重

2.2 病理組織學(xué)改變情況

HE染色顯示，正常對(duì)照組小鼠小腸黏膜組織上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、排列整齊，無(wú)腫脹、壞死、腸黏膜斷裂等情況，隱窩排列整齊。而單純照射組與正常對(duì)照組比，部分腸絨毛斷裂脫落，腸上皮結(jié)構(gòu)部分消失、隱窩排列紊亂(部分丟失)，腺體腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。2 mg LF+照射組與單純照射組比，腸絨毛斷裂脫落情況稍有好轉(zhuǎn)，但隱窩排列紊亂。4 mg LF+照射組與單純照射組比，腸絨毛和隱窩排列逐漸好轉(zhuǎn)。6 mg LF+照射組與單純照射組比，腸絨毛結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常、隱窩排列整齊(圖1)。

正常對(duì)照組 單純照射組

2mg LF+照射組 4mg LF+照射組 6mg LF+照射組

2.3 血清DAO、TGF-β水平

與正常對(duì)照組比，單純照射組小鼠血清DAO、TGF-β水平明顯升高(P<0.05)。與單純照射組比，各LF組小鼠血清DAO水平均降低(P<0.05)；4 mg LF+照射組和6 mg LF+照射組血清TGF-β水平降低(P<0.05)。與單純照射組比，2 mg LF+照射組血清TGF-β水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 各組小鼠血清中DAO、TGF-β水平

2.4 小鼠小腸MDA、SOD、NO含量

與正常對(duì)照組比，單純照射組小鼠小腸組織勻漿MDA、SOD、NO水平均有明顯改變，其中MDA、NO水平明顯升高(P<0.05)，SOD活性下降(P<0.05)。與單純照射組相比，4 mg LF+照射組和6 mg LF+照射組的MDA、NO水平下降(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。與單純照射組小鼠比，2 mg LF+照射組小鼠小腸組織MDA、NO、SOD水平變化不明顯(P>0.05，表3)。

表3 各組小鼠小腸組織勻漿中MDA、SOD和NO水平

3.討論

急性放射性腸損傷發(fā)生在放療初期，是由增殖迅速的小腸隱窩上皮細(xì)胞的死亡和小腸固有層細(xì)胞持續(xù)性的急性炎癥反應(yīng)所致[1，7]。為避免正常組織發(fā)生放射損傷，可通過(guò)干擾輻射傷害機(jī)制，調(diào)節(jié)輻射下游發(fā)生的病理生理過(guò)程，提高放射線耐受性，避免正常組織損傷、增強(qiáng)修復(fù)能力，來(lái)預(yù)防、阻止放射性腸損傷的發(fā)生、發(fā)展[1]。然而放射性腸損傷尚無(wú)特異有效的防治措施[2]。因此，探討放射性腸損傷可能存在的機(jī)制，積極地對(duì)放射性腸損傷進(jìn)行預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。

LF具有廣泛的生理與藥理作用。Anne Blais[8]等研究發(fā)現(xiàn)，LF在體外促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞的增殖。Feng L[4]等研究發(fā)現(xiàn)，LF可增加小鼠的PLT和白細(xì)胞計(jì)數(shù)并減少DNA損傷，具有一定的抗輻射損傷作用。LF還可作為轉(zhuǎn)錄因子參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與DNA序列高效特異結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)TGF-β的表達(dá)[9]。LF具有阻斷人癌細(xì)胞周期、下調(diào)細(xì)胞周期蛋白E1水平、誘導(dǎo)S期延長(zhǎng)[10]；誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11]；抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[12，13]等抗癌作用。并且增加NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11，14，15]。Marian L.Kruzel[16]等研究發(fā)現(xiàn)，LF可抑制與超氧化物分子的自由鐵(Fe3+)離子反應(yīng)性，控制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生及其消除速率的生理平衡，通過(guò)限制羥基自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化，緩沖了氧化性細(xì)胞損傷。但是LF對(duì)放射性腸損傷的防治作用及其機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究在成功建立小鼠放射性腸損傷的基礎(chǔ)上，探討LF對(duì)小鼠腸道放射損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，照射后小鼠出現(xiàn)稀水樣便等胃腸道反應(yīng)，單純照射組小鼠體重明顯降低，小腸組織病理出現(xiàn)小腸絨毛斷裂脫落、正常結(jié)構(gòu)消失，小腸隱窩細(xì)胞增殖受限，凋亡上調(diào)，腸隱窩排列紊亂，腺體腔被炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，達(dá)到放射性腸損傷病理標(biāo)準(zhǔn)[6]。而LF減輕了小鼠的小腸黏膜病理?yè)p傷(小腸絨毛斷裂脫落減少，隱窩排列逐漸整齊)。血漿DAO是存在于腸絨毛上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)具有高度活性的細(xì)胞質(zhì)酶，射線照射破壞腸絨毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)致胞質(zhì)內(nèi)DAO釋放入血。因此，DAO可作為早期腸黏膜損傷和恢復(fù)變化的較敏感指標(biāo)[17]。受照射后，小鼠血漿DAO明顯升高，說(shuō)明照射致小鼠小腸絨毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，發(fā)生早期的小腸黏膜損傷。各LF組小鼠DAO含量較單純照射組少，表示LF可以一定程度恢復(fù)腸絨毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)，緩解小腸黏膜損傷。王億龍[18]等對(duì)小鼠放射性腸損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，射線照射誘導(dǎo)NO合酶活性增高，產(chǎn)生大量的NO，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性和環(huán)磷腺苷的合成，造成腸上皮細(xì)胞的損傷，NO水平可作為放射性腸損傷程度的指標(biāo)。照射后小鼠小腸組織勻漿NO水平明顯增高，導(dǎo)致小鼠放射性腸損傷，4 mg、6 mg LF+照射組小鼠小腸組織勻漿NO水平較單純照射組低，表示LF可以降低放射性腸損傷的嚴(yán)重程度起到保護(hù)作用。與ROS對(duì)應(yīng)的還原系統(tǒng)中的SOD的活性反映輻射對(duì)腸道氧化應(yīng)激的影響[19]。由于細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的氧化，ROS的形成會(huì)導(dǎo)致MDA分泌，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映小腸組織輻射后損傷程度[20，21]。本實(shí)驗(yàn)單純照射組小鼠受照射后小腸組織SOD活性明顯下降，MDA含量升高，腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，LF干預(yù)小鼠恢復(fù)SOD活性，并且使MDA含量降低，推測(cè)LF可以通過(guò)緩解小鼠腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)降低放射性腸損傷程度。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，輻射導(dǎo)致TGF-β免疫反應(yīng)性持續(xù)增強(qiáng)。TGF-β作為有效的纖維化和促炎性細(xì)胞因子，在腸壁免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中起重要作用，抑制TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)可降低放射性腸病的臨床反應(yīng)[22]，TGF-β1還可增加線粒體ROS的產(chǎn)生，從而影響腸道氧化應(yīng)激水平[19，23，24]。照射后小鼠血清TGF-β水平升高明顯，免疫反應(yīng)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激水平升高，而4 mg、6 mg LF組小鼠的TGF-β水平較單純照射組小鼠低，說(shuō)明LF可以降低炎癥因子的分泌水平，減輕腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)。另外，本實(shí)驗(yàn)全程在平均海拔2 000米以上的青海地區(qū)完成，高原地區(qū)低氧環(huán)境使體內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)水平上調(diào)[25]，體內(nèi)HIF水平的上調(diào)，會(huì)刺激腸道樹突狀細(xì)胞發(fā)揮免疫作用[26]和減輕腸道上皮細(xì)胞及腸道隱窩干細(xì)胞損傷，一定程度起到使腸道組織免受輻射損傷的作用[27]，其效果與LF可能存在協(xié)同作用。低氧的環(huán)境也會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)增強(qiáng)[28]，VEGF上調(diào)保護(hù)腸道微血管內(nèi)皮，減輕腸道損傷[27]。以上因素可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

綜上所述，表明LF對(duì)放射性腸損傷具有一定的防治作用，其作用機(jī)制可能與減輕腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥因子分泌和減弱炎癥反應(yīng)有關(guān)。