溫度響應(yīng)上位抑制草莓開花基因FaDSF遺傳模型分析

阮繼偉，孫建麗，萬 紅，單芹麗，田林孟，蔣海玉，楊春梅*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，云南 昆明 650205；4. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】溫度和光周期是誘導(dǎo)鳳梨草莓(Fragaria×ananassaDuch., 2n=8x=56)開花的主要環(huán)境信號(hào)[1-4]。根據(jù)開花習(xí)性的不同，鳳梨草莓可分為季節(jié)性草莓(Seasonal-flowering，SF)和四季草莓(Perpetual-flowering, PF)。季節(jié)性草莓也稱短日照草莓，其在秋季低溫短日照條件下完成花芽分化并在冬春季開花結(jié)果，而在夏季長日照條件下花芽分化停止，夏秋季不開花結(jié)果[5-7]；四季草莓在(適宜生長溫度)夏季長日照條件下也可完成花芽分化并開花結(jié)果，從而擴(kuò)展果實(shí)采收期[8-10]。對(duì)關(guān)鍵性狀的遺傳解析是支撐精細(xì)化育種與定向遺傳改良的基礎(chǔ)。鳳梨草莓為異源八倍體，其基因組組成復(fù)雜, 其中來自森林草莓(Fragariavesca)的亞基因組具有亞基因組優(yōu)勢(Sub-genome Dominance)，導(dǎo)致很多性狀的遺傳表現(xiàn)出二倍體的遺傳現(xiàn)象[11]。雖然四季草莓品種有不同的來源[1,5,9,12-13]。但最新的系列研究表明，不同來源的四季草莓夏季開花性狀受控于同一主效位點(diǎn)FaPFRU的調(diào)控[14-20]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】然而，當(dāng)利用緊密連鎖的Bx083_206，Bx215_131[17,20]，F(xiàn)ANhyb19.1-15-21和 FANhyb19.1-15-21[21]等分子標(biāo)記來預(yù)測植株開花表型時(shí)，陰性標(biāo)記可準(zhǔn)確預(yù)測季節(jié)性植株；而陽性標(biāo)記的植株僅45 %～85 %表現(xiàn)四季性。Lewers 等[21]基于多(4)年多(67)雜交群體表型評(píng)價(jià)，依據(jù)親本基因型(分子標(biāo)記)和表型(四季性或季節(jié)性)預(yù)測后代表型分離比例，并與實(shí)際分離比例比對(duì)分析后認(rèn)為至少有2個(gè)基因(分別為顯性和隱性)上位抑制FaPFRU，導(dǎo)致部分具有FaPFRU顯性分子標(biāo)記的株系表現(xiàn)季節(jié)性。其中顯性抑制基因(Dominant Suppressor Flowering,FaDSF)在播種當(dāng)年表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，越冬之后FaDSF基因的抑制效應(yīng)消失，即FaDSF基因具有響應(yīng)溫度信號(hào)調(diào)節(jié)開花的功能；FaDSF基因的抑制作用使一些雜交群體在播種當(dāng)年四季性和季節(jié)性植株分離比例符合1∶3，而越冬之后年份的分離比例符合1∶1[21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用在不同年份先后2次雜交構(gòu)建 ‘章姬’בAlbion’F1群體，母本是季節(jié)性草莓(基因型：pfrupfru)，父本是四季草莓(基因型：PFRUpfru)。在播種當(dāng)年及越冬后的2個(gè)年份，調(diào)查群體表現(xiàn)四季性和季節(jié)性植株的分離比例，分析溫度響應(yīng)抑制開花基因FaDSF的分離和遺傳模型?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究FaDSF基因在‘章姬’בAlbion’群體中的分離情況和遺傳模型，為FaDSF基因定位和分子遺傳信息的挖掘提供分離群體和遺傳模型支持，也為研究溫度影響草莓開花的分子機(jī)理提供了一個(gè)切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

季節(jié)性草莓品種‘章姬’和四季草莓品種‘Albion’定植于高架基質(zhì)栽培槽內(nèi)，按Ruan等[22]的方式管理植株。以‘章姬’作為母本，‘Albion’為父本分別于2013年10月和2017年10月雜交。母本花朵露白期(未開放)人工去雄，標(biāo)記；父本花朵露白期取花蕾至室內(nèi)干燥密閉環(huán)境保存獲取花粉；人工隔離授粉，授粉后50 d左右雜交果實(shí)完全成熟，從成熟的果實(shí)上取雜交種子，洗凈后放烘箱(上海博訊BGZ-240)內(nèi)40 ℃烘干72 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別播種2次雜交構(gòu)建的‘章姬’בAlbion’種子，成苗后定植于高架基質(zhì)栽培槽內(nèi)養(yǎng)護(hù)，調(diào)查播種當(dāng)年，次年及第3年F1群體各單株開花性狀，根據(jù)植株開花性狀(四季性或季節(jié)性)的分離比例，分析FaDSF基因的遺傳模型。

1.3 試驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)地位于云南省玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)的云南農(nóng)業(yè)科技園內(nèi)(北緯24°18′，海拔1760 m)。2014年3月8日和2018年2月28日分別播種2013年和2017年雜交獲得的‘章姬’בAlbion’種子，2014年5月8日和2018年4月20日分別將播種后成苗植株定植于高架基質(zhì)栽培槽內(nèi)，各單株分別標(biāo)號(hào)；2個(gè)雜交群體按先后順序分別命名為群體1(2013年雜交)和群體2(2017年雜交)。播種和養(yǎng)護(hù)參照Ruan等[22]的方法，群體1定植后植株一直養(yǎng)護(hù)到2016年數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)束；群體2定植后植株一直養(yǎng)護(hù)到2019年數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)束，2019年9-10月營養(yǎng)繁殖各單株子苗，并于11月重新定植用于2020年的數(shù)據(jù)收集。

1.3.1 開花性狀調(diào)查 群體1：2015年(播種次年)和2016年(播種后第3年)7月1日至8月31日，參照Ruan等[22]的方法，調(diào)查群體內(nèi)各單株萌發(fā)花序數(shù)；2015年有478株，2016年有455株。由于2014年播種晚，肥水管理不佳導(dǎo)致植株生長慢，2014年7月和8月群體內(nèi)無任何植株萌發(fā)花序，調(diào)查群體內(nèi)各單株(483株)第1花序萌發(fā)時(shí)間來確定植株的開花表型。

群體2：2018年(播種當(dāng)年)，2019年(播種后次年)和2020年(播種后第3年)7月1日至8月31日，調(diào)查群體內(nèi)存活各單株萌發(fā)的花序數(shù)。2018年292株存活，2019年有292株存活，2020年有274株存活。

1.3.2 開花性狀分離比例及遺傳模型分析 參照Ruan等[22]的方法，每年7月1日至8月31日，萌發(fā)2個(gè)花序的植株認(rèn)定為具有四季開花習(xí)性，期間沒有萌發(fā)花序或僅萌發(fā)1個(gè)花序的植株認(rèn)定為具有季節(jié)開花習(xí)性。群體1植株2014年的開花表型根據(jù)第1花序萌發(fā)時(shí)間來確定。根據(jù)2雜交群體多年開花性狀(四季性和季節(jié)性)分離比例，綜合分析FaDSF基因遺傳模型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

觀察記錄的原始數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行處理和卡平方檢測。

圖1 群體1播種當(dāng)年(2014年)第1花序萌發(fā)時(shí)間分布頻率

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交群體開花表型

群體1：2014年存活的483單株第1花序萌發(fā)時(shí)間為2014年9月至2015年1月，各月萌發(fā)花序的單株數(shù)見圖1，其中2014年9月124株，10月29株，11月304株，12月21株，2015年1月5株。2014年9月和11月分別有1個(gè)峰值，根據(jù)正態(tài)分布規(guī)律，將9月萌發(fā)第1花序(124株)和10月1-15日萌發(fā)第1花序(8株)的132單株認(rèn)定為具有四季性開花性狀，其他植株(351株)認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀。2015年存活的468株F1單株萌發(fā)花序數(shù)為0～20，其中萌發(fā)2個(gè)及以上花序的212株認(rèn)定為具有四季開花性狀；未萌發(fā)花序的194株，萌發(fā)1個(gè)花序的62株，共256株認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀(圖2-A)。2016年存活的455株F1代單株萌發(fā)花序數(shù)為0～39，其中萌發(fā)2個(gè)及以上花序的224株認(rèn)定為具有四季開花性狀；未萌發(fā)花序的190株，萌發(fā)1個(gè)花序的41株，共231株認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀(圖2-A)。

圖3 群體2播種當(dāng)年(2018年)夏季花序數(shù)分布頻率

群體2：2018年存活的292株F1代單株萌發(fā)花序數(shù)為0～18，其中萌發(fā)2個(gè)及以上花序的80株認(rèn)定為具有四季開花性狀；未萌發(fā)花序的185株，萌發(fā)1個(gè)花序的27株，共212株認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀(圖3)。2019年存活的292株F1代單株萌發(fā)花序數(shù)為0～27，其中萌發(fā)2個(gè)及以上花序的144株認(rèn)定為具有四季開花性狀；未萌發(fā)花序的132株，萌發(fā)1個(gè)花序的16株，共148株認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀(圖2-B)。2020年存活的274株F1代單株萌發(fā)花序數(shù)為0～15，其中萌發(fā)2個(gè)及以上花序的130株認(rèn)定為具有四季開花性狀；未萌發(fā)花序的114株，萌發(fā)1個(gè)花序的30株，共144株認(rèn)定為具有季節(jié)性開花性狀(圖2-B)。

2.2 雜交群體開花表型分離比例與遺傳模型分析

圖2 群體1(A)和群體2(B)播種后2年夏季花序數(shù)分布頻率

表1 ‘章姬’ × ‘Albion’2次雜交F1群體中四季性和季節(jié)性植株分離情況

群體1：2014年群體表現(xiàn)四季性和季節(jié)性植株的分離比例符合1∶3(表1，χ2=1.40)，而在植株越冬后的2015年和2016年分離比例符合1∶1(χ2=2.42，0.11)。在2015年表現(xiàn)四季性的222株F1代單株中，102株在播種當(dāng)年(2014年)表現(xiàn)四季性，120株表現(xiàn)季節(jié)性，分離比例符合1∶1(χ2=21.45)；在2016年表現(xiàn)四季性的224株F1代單株中，106株在播種當(dāng)年(2014年)表現(xiàn)四季性，118株表現(xiàn)季節(jié)性，分離比例符合1∶1(χ2=0.64)。

群體2：2018年群體表現(xiàn)四季性和季節(jié)性植株的分離比例符合1∶3(χ2=0.89)，而在植株越冬后的2019年分離比例符合1∶1(表1，χ2=0.05)。在2019年表現(xiàn)四季性的144株F1代單株中，67株在播種當(dāng)年(2018年)表現(xiàn)四季性，77株表現(xiàn)季節(jié)性，分離比例符合1∶1(χ2=0.69)；在2020年表現(xiàn)四季性的130株F1代單株中，69株在播種當(dāng)年(2018年)表現(xiàn)四季性，61株表現(xiàn)季節(jié)性，分離比例符合1∶1(χ2=0.49)。

根據(jù)2個(gè)群體多年表型評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在播種當(dāng)年有1個(gè)基因，其上位抑制夏季開花性狀；即在‘章姬’בAlbion’雜交群體中存在Lewers 等[21]報(bào)道的響應(yīng)溫度信號(hào)抑制開花的FaDSF基因。

3 討 論

3.1 雜交群體開花表型及評(píng)價(jià)

夏季(7和8月)是否萌發(fā)花序是判斷植株是否具有四季性的通用標(biāo)準(zhǔn)[23-24]。由于云南地處低緯高原夏季氣候溫和，季節(jié)性草莓品種‘章姬’及其自交群體植株有10 %在7和8月萌發(fā)1個(gè)花序[22]，故在本實(shí)驗(yàn)中，參照之前的經(jīng)驗(yàn)[22]將萌發(fā)2個(gè)及以上花序的植株判定為具有四季性，不萌發(fā)或僅萌發(fā)1個(gè)花序的植株判定為具有季節(jié)性。

由于群體1在2014年播種晚，苗期及定植后肥水管理不佳導(dǎo)致植株生長慢，2014年7月和8月群體內(nèi)無任何植株萌發(fā)花蕾，我們根據(jù)各單株第1花序萌發(fā)時(shí)間來確定植株的開花表型，萌發(fā)時(shí)間顯示出2個(gè)峰值(圖1)，將第1個(gè)峰值周圍的植株(10月15日前萌發(fā)花序)的植株認(rèn)定為具有四季性，第2個(gè)峰值周圍的植株(10月15日后萌發(fā)花序)認(rèn)定為具有季節(jié)性。

3.2 雜交群體開花表型分離比例與遺傳模型分析

雖然四季草莓品種有不同的來源[1,5,9,12-13]。但最新的系列研究表明，不同來源的四季草莓夏季開花性狀受控于同一主效位點(diǎn)FaPFRU的調(diào)控[14-20]。在前面的研究中[22]，通過季節(jié)性草莓‘章姬’和四季性草莓‘阿爾比’2個(gè)自交群體和1個(gè)雜交群體多年表型評(píng)價(jià)和遺傳模型分析認(rèn)為，四季草莓‘阿爾比’的基因型是PFRUpfru，而季節(jié)性草莓‘章姬’的基因型是pfrupfru, 他們的雜交后代中有一半的基因型是PFRUpfru，另一半是pfrupfru。這可以解釋雜交群體中四季性和季節(jié)性植株分離比例符合1∶1。

在播種當(dāng)年分別2次雜交構(gòu)建‘章姬’בAlbion’F1群體，四季性植株和季節(jié)性植株的分離比例符合1∶3，這證明有另外一個(gè)基因在播種當(dāng)年抑制植株表現(xiàn)四季性，這和Lewers 等[21]的研究結(jié)論是一致的。將這上位抑制植株開花的基因標(biāo)記為FaDSF,以便下面的闡述。

由于FaDSF在播種當(dāng)年具有上位抑制FaPFRU基因的作用，具有PFRUpfru基因型的F1代植株，理論上有一半的植株具有DSFdsf基因型，另一半具有dsfdsf基因新型。也就是僅理論上占雜交群體1/4的植株(基因型為PFRUpfrudsfdsf)在播種當(dāng)年表現(xiàn)四季性；而雜交群體另外3/4的植株(基因型為PFRUpfruDSFdsf)在播種當(dāng)年表現(xiàn)季節(jié)性。

參照和比對(duì)草莓屬已有的開花調(diào)控途徑，將有助于鑒定FaDSF基因并明確其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。已有的研究成果對(duì)森林草莓和鳳梨草莓開花的光周期調(diào)控分子途徑“CO-FT-SOC1-TFL1”進(jìn)行了深入闡述。在夏季長日照條件下，CO在葉片上調(diào)表達(dá)(栽培草莓暫無報(bào)道)，進(jìn)而激活FT在葉片上調(diào)表達(dá)，再進(jìn)而激活SOC1在莖尖上調(diào)表達(dá)，再進(jìn)而激活TFL1在莖尖上調(diào)表達(dá),TFL1是花芽分化的抑制基因(抑制花芽分化基因API和花蕾發(fā)育基因FT3表達(dá))，其上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致草莓植株花芽不分化[4,25-29]。森林草莓中FvTFL1基因第一外顯子2個(gè)堿基的缺失導(dǎo)致FvTFL1基因不能轉(zhuǎn)錄從而使突變株夏季開花，表現(xiàn)四季性。栽培草莓中FaFT1同源基因FaPFRU基因的導(dǎo)入導(dǎo)致下游FaSOC1和FaTFL1下調(diào)表達(dá)，植株夏季開花，表現(xiàn)四季性。

然而，溫度調(diào)控草莓開花的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的很少。已有的研究推測溫度通過“CO-FT-SOC1-TFL1”以外的其他調(diào)控途徑，間接或直接調(diào)控TFL1基因并達(dá)到調(diào)控鳳梨草莓和森林草莓開花的效應(yīng)[3-4, 26]，但調(diào)控的路徑和機(jī)理尚不清楚。Urrutia等[30]在導(dǎo)入布哈拉草莓(F.bucharica)部分基因的四季性森林草莓近等基因系(NIL)6號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)1基因有類似FaDSF的功能，即在播種當(dāng)年抑制四季性，并推測其可能是FvTFL1。Koskela等[31]的研究證實(shí)FvTFL1啟動(dòng)子區(qū)域1堿基的缺失導(dǎo)致蛋白結(jié)合位點(diǎn)變化，使森林草莓特異株系(arctic woodland strawberry accession)需要較長時(shí)間的低溫積累下調(diào)FvTFL1表達(dá)量后，植株才能感受外界開花信號(hào)分化花芽。

參照擬南芥，F(xiàn)LC，SVP和H2A.Z基因是感受溫度信號(hào)調(diào)控開花基因[32-34]。其中SVP和H2A.Z蛋白感受溫度信號(hào)在開花相關(guān)基因FT啟動(dòng)子區(qū)域富集，通過調(diào)控開花基因FT表達(dá)量調(diào)控開花。由于草莓屬中未發(fā)現(xiàn)FLC同源基因[35]，考慮溫度信號(hào)是否是通過FaSVP和FaH2A.Z基因介導(dǎo)間接調(diào)控FaTFL1基因達(dá)到調(diào)控鳳梨草莓開花的效應(yīng)。

如果著眼更寬的溫度范圍，只要低于光敏下限溫度(≈15 ℃)，無論季節(jié)性和四季性草莓都能分化花芽；而高于光敏上限溫度(≈26 ℃)，無論季節(jié)性和四季性草莓都不能分化花芽；在2個(gè)溫度范圍內(nèi)，光周期調(diào)控才起作用[2,4,29,36-37]。森林草莓也有相同的溫度調(diào)控現(xiàn)象[3,29]。

基于以上分析，在下一步的研究中至少有以下問題需要回答：響應(yīng)溫度信號(hào)的FaDSF基因是FaTFL1基因嗎？抑或是調(diào)控FaTFL1基因的FaSVP或FaH2A.Z等基因？鳳梨草莓不論日照長短，低于光敏下限溫度促進(jìn)開花而高于光敏上限溫度抑制開花，F(xiàn)aDSF基因是否參與了這一現(xiàn)象的調(diào)控？回答這些問題需要針對(duì)FaDSF基因開展分子層面的研究，本研究證明在‘章姬’בAlbion’雜交群體中存在FaDSF基因分離群體，并闡述了其遺傳模型，這為開展FaDSF基因定位和分子生物學(xué)研究提供了遺傳群體和遺傳模型支撐。

4 結(jié) 論

在‘章姬’בAlbion’雜交群體中存在溫度相應(yīng)抑制開花的FaDSF基因分離群體，其顯性并上位抑制FaPFRU基因。這為開展FaDSF基因定位和分子生物學(xué)研究提供了遺傳群體和遺傳模型支撐，也為研究溫度影響草莓開花的分子機(jī)理提供了一個(gè)切入點(diǎn)。