植物根際促生菌(PGPR)解磷菌的篩選及其對番茄促生作用的研究

賀字典，高玉峰*，王 燕，李翠霞，高歆瑤，張志浩

(1.河北科技師范學院，河北 秦皇島 066600；2.盧龍縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 秦皇島 066600；3.滄州市開發(fā)區(qū)中心學校，河北 滄州 061000)

【研究意義】植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是植物根際周圍土壤中的一群自生細菌，通過產(chǎn)生抗生素和分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害、重金屬、鹽脅迫等對植物產(chǎn)生的不良影響，還能通過解磷、固氮、產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長[1-3]。土壤中存在大量的PGPR，主要包括假單胞菌屬(Pseudemonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)[4]，它們能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為農(nóng)作物可吸收利用的可溶性磷，促進農(nóng)作物生長，改善土壤環(huán)境，顯著提高土壤中的有效磷含量。磷肥能夠增強番茄根系活力，使根系吸收養(yǎng)分能力加強，番茄根系中氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量增加，提高番茄葉片中可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量。而且能夠增加果實中可溶性糖含量、維生素C和可溶性固形物含量[5]?！厩叭搜芯窟M展】隨著番茄栽培面積的不斷擴大，為追求番茄高產(chǎn)，不斷增加磷肥施入量。施入土壤中的磷素大部分被土壤固定，只有10 %～25 %被當季作物吸收利用，造成大部分磷元素浪費。在國家實施減肥減藥增效政策的支持下，如何將土壤中被固定住的、難溶性的磷釋放出來，被番茄吸收利用，PGPR將發(fā)揮重要作用。PGPR與生物炭配施提高了番茄根際土微生物群落多樣性，顯著提高了硝化螺旋菌屬和慢生根瘤菌屬的相對豐度[6]。用JD37菌株處理的番茄種子，能夠顯著促進番茄初生苗側(cè)根的生長，與對照相比，番茄幼苗的平均根長、平均苗高、平均鮮重和平均干重分別提高了37.41 %、18.20 %、69.62 %、70.97 %[7]。番茄種子在用蒸餾水浸泡后并在移栽時加含有 CS1(Pseudomnasputida, 惡臭假單胞菌) 和CS2(Enterobactercloacae, 陰溝腸桿菌) 2種促生菌的藻原膠珠子的種植方式可以提高番茄的產(chǎn)量[8]。【本研究切入點】本文從多年連作土壤和海邊鹽生植物根際土壤中篩選出產(chǎn)生ACC脫氨酶的PGPR，在離體條件下篩選出具有解磷效果的菌株后，測定PGPR對番茄幼苗與結(jié)果期番茄生長性狀以及根圍土壤養(yǎng)分的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究為PGPR在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PGPR供試菌株：AHG-1，AHG-2，AHG-4，AHG-5，LZT-1，LZT-5，LZT-7，LZT-8，F(xiàn)QG-1，F(xiàn)QG-3，F(xiàn)QG-5，F(xiàn)QG-6，CRG-1，CRG-3，CRG-8共15株，本實驗室自種植不同連作年限溫室土壤、番茄根際土壤和鹽生植物根際土壤中分離、保存。供試番茄品種：京T301，北京中農(nóng)綠亨種子科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

無機磷培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，磷酸鈣5 g，葡萄糖10 g，MnSO4·H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2，不加瓊脂即為液體培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.5。NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4。

1.3 試驗方法

1.3.1 PGPR菌種活化與菌懸液制備 將4 ℃保存的15株P(guān)GPR菌種，分別接種到NA平板上。2 d后將長好的15株P(guān)GPR分別接入120 mL LB液體培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)中，28 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)36 h后，用無菌水稀釋菌液至活菌密度為108cfu·mL-1，備用。

1.3.2 解磷效果篩選 將牛津杯置于無機磷固體培養(yǎng)基中央，用移液槍吸取100 μl已制備好的PGPR菌懸液注入到牛津杯中，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，十字交叉測量解磷透明圈直徑。

1.3.3 PGPR育苗土準備 將篩選出來的解磷菌株用液體解磷培養(yǎng)基擴繁，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為108cfu·mL-1后，按照5 %和10 %的體積/重量比(V/W)比例與草炭︰蛭石=2︰1的育苗基質(zhì)混勻，并保持濕潤，7 d后裝育苗盤，以清水為對照。

1.3.4 番茄種子催芽和播種 挑選大小均一、籽粒飽滿的番茄種子。將番茄種子用涼水浸泡30 min，再用50 ℃的溫水攪拌浸泡20 min。撈出后均勻放入鋪有濕紗布的保濕盒內(nèi)催芽待種子露白后播種于32孔穴盤中，每穴2粒種子，正常管理。

1.3.5 PGPR灌根 試驗地點選擇在河北科技師范學院開發(fā)區(qū)校區(qū)試驗田。小區(qū)面積1 m×6 m，株行距35 cm×30 cm，隨機排列。等番茄緩苗后和開花前使用灌根法澆灌PGPR，每株100 mL。并以三本農(nóng)好有機肥3000 kg·hm-2、羊糞+尿素3000 kg·hm-2、生物炭復(fù)合肥150 kg·hm-2為對照。

1.3.6 番茄生長性狀的測定 當番茄幼苗長至3片真葉時，分別測量5 %和10 % PGPR對番茄生長性狀的影響，每個處理取10株，用自來水將番茄根際的基質(zhì)輕輕沖掉，測量番茄幼苗株高、莖粗、葉長、葉寬、地上部、地下部的鮮重和干重。剩下的番茄苗移栽到露地實驗地，在初果期使用德國WALZ公司生產(chǎn)的光合儀GSF-3000于上午10:00-12:00測定番茄葉片的光合作用。每株測定果實上下各2片番茄葉片的光合作用，每畦測10株。同時測定莖粗等其他生長性狀。

1.3.7 番茄根圍土壤養(yǎng)分的測定 當番茄植株長至3片真葉和初果期時，對植株根際的土壤進行取樣，在實驗室通風晾干后，挑揀出砂石和植物體殘渣并用研缽碾碎過20目篩。有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀滴定法測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；全鉀含量采用氫氧化鈉熔融法-火焰光度法測定；速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用NH4AC浸提-火焰光度法測定[9-10]。

1.3.8 解磷細菌的鑒定 采用細菌DNA試劑盒提取解磷菌DNA。①將菌株分別接種于液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)2 d。②取1.5 mL培養(yǎng)物于離心管中，在離心機下以12 000 r/min離心2 min。③沉淀物加入567 μl的TE緩沖溶液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30 μl 10 %SDS和15 μl的蛋白酶K，混勻，于37 ℃溫1 h。④加入100 μl 5 mol·L-1NaCl，充分混勻，再加入80 μl CTAB/NaCl 溶液，混勻后再于65 ℃溫育10 min。⑤加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4～5 min，將上清轉(zhuǎn)到新管中，加入0.6～0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。⑥沉淀用70 %的乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，重溶于20 μl TE緩沖溶液(含RNaseA< 25 ng/mL)中，備用。

采用細菌通用引物F27(5’-AGAGTTTGATCTTGGCTCAG-3’)和P1492r(5’-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3’)對16 Sr DNA序列進行擴增和測序。PCR反應(yīng)體系為Premix 12.5 μl，10 μmol·L-1引物各1 μl，模板DNA 1 μl，以ddH2O補足至25 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35個循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。

將PCR擴增樣品送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，分別以F27和P1492r為測序引物，雙向測通序列。將測序結(jié)果進行拼接后，取一完整序列在GenBank上進行序列比對，參考相似度、同源性最高的菌株對目標菌株進行分類鑒定。采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對序列親緣關(guān)系進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SAS 9.1.3軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析、LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR解磷效果

在15株P(guān)GPR菌株中，以FQG-5的解磷透明圈直徑最大，為2.33 cm，其次是LZT-5、FQG-6和FQG-3的解磷透明圈分別為2.27，2.17 cm，四者差異不顯著，但顯著高于其他菌株的解磷透明圈(表1)。

2.2 PGPR對番茄幼苗生長性狀及土壤養(yǎng)分的影響

表2顯示，將5 %和10 %的FQG-5和LZT-5 2種PGPR分別加入到番茄育苗基質(zhì)后，番茄幼苗地上部鮮重和地下部鮮重分別為1.23，1.29，1.12，1.19 g和0.19，0.20，0.18，0.18 g，四者間差異不顯著，但均顯著高于清水對照。番茄幼苗地上部干重以10 % FQG-5處理的最重為0.04 g，顯著高于其他處理。用FQG-5和LZT-5處理的番茄幼苗地下部干重均顯著高于清水對照。同樣用10 % FQG-5和LZT-5處理的育苗基質(zhì)栽培的番茄幼苗株高、莖粗和葉面積最高，分別為13.66 cm、0.35 cm、28.95 cm2和13.70 cm、0.36 cm、29.75 cm2，顯著高于其他處理。

表3顯示，將10 % FQG-5加入到番茄育苗基質(zhì)中測定番茄根圍土壤養(yǎng)分，全氮、全磷、全鉀、銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量分別為245.2，73.0，268.7，70.59，43.45，160.42 mg·kg-1和40.22 g·kg-1。10 % FQG-5與其他PGPR菌株處理后的番茄根圍土壤養(yǎng)分含量相比，除了銨態(tài)氮含量差異不顯著外，其他6種養(yǎng)分含量均顯著增高。

表1 PGPR解磷透明圈直徑

表2 PGPR對番茄幼苗生長性狀的影響

表3 PGPR對番茄幼苗根圍土壤養(yǎng)分的影響

2.3 PGPR對露地番茄成株期生長性狀和土壤養(yǎng)分的影響

表4顯示，PGPR灌根后的番茄莖粗為0.90 cm、株高為88.70 cm、葉面積為18.08 cm2、光照強度為5905 lx、產(chǎn)量為42 371.18 kg·hm-2，分別為生物炭+復(fù)合肥的1.10、1.11、1.13、1.19和1.19倍，顯著于其他對照。

表4 PGPR對露地番茄成株期生長性狀的影響

表5 PGPR對露地番茄根圍土壤養(yǎng)分的影響

表6 PGPR解磷菌種類

表5顯示，用10 %FQG-5灌根處理的露地番茄根圍的速效磷為40.05 mg·kg-1、速效鉀193.00 mg·kg-1、銨態(tài)氮78.30 mg·kg-1、硝態(tài)氮50.53 mg·kg-1、有機質(zhì)37.79 g·kg-1、全氮0.80 g·kg-1、全磷0.79 g·kg-1、全鉀2.03 g·kg-1，分別為生物炭+復(fù)合肥的1.11、1.46、1.26、1.10、1.66、1.33、1.22和1.43倍，均顯著高于其它處理。

2.4 PGPR解磷菌的鑒定

由表6及圖1可以看出，將PGPR菌株的16SrRNA序列測序后，經(jīng)過與Genbank中的16SrRNA序列比對后15株P(guān)GPR分屬于8個種的細菌，分別為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、土生拉烏爾菌(Raoultellaterrigena)、土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、克呂沃爾氏菌(Kluyveracryocrescens)、不動桿菌(Acinetobacter)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)。其中解磷效果較好的菌株LZT-5為不動桿菌(Acinetobacter)。FQG-5為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。FQG-6和FQG-3分別為成團泛菌(Pantoeaagglomerans)和土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

3 討 論

從連作番茄和鹽生雜草根際土壤中15株P(guān)GPR中分離到2株解磷效果較好的菌株LZT-5和FQG-5，分別為不動桿菌屬細菌(Acinetobacter)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)。PGPR能促進番茄根圍難溶性磷肥的轉(zhuǎn)化與吸收，用10 % FQG -5灌根處理的露地番茄根圍的速效磷為40.05 mg·kg-1，顯著高于其他肥料處理的速效磷含量。

國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)20多個種屬的根際微生物具有防病促生的潛能，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌桿菌屬(Pseudemonas)在很多植物的根圍都占了絕對優(yōu)勢，可達60 %～93 %的比例[11-12]。PGPR功能主要包括固氮作用、解磷作用、解鉀作用、降解重金屬、防治植物病害等[13]。Toshy Agrawal 等篩選到溶磷效果好的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)菌株P(guān)132[14]。解磷菌能在土壤有效磷減少的情況下，將植物難以吸收利用的難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)，提高土壤中磷素的利用效率，從而減少化學肥料的施用[15]。

圖1 基于16srRNA的 FQG-5和LZT-5與代表種系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜

PGPR通過提高土壤有機質(zhì)、全磷、速效磷、全鉀、速效鉀含量，從而對鷹嘴豆和玉米幼苗和成株均有促生作用，顯著提高其鮮重、干重、葉面積等生長性狀，還能促進葉片的光合作用，提高產(chǎn)量[16-18]。本文結(jié)果與前人結(jié)果相似，PGPR在溶解難溶性磷為植物吸收狀態(tài)時，也會增加植物體內(nèi)磷的存貯量，成為植酸磷[16]。但不同環(huán)境條件下分離到的解磷菌種類不同，解磷效果和促生作用也不相同[19-21]，PGPR施用土壤后效果如何與其在土壤中的定殖量[22]、生態(tài)條件[23-25]有關(guān)，還與土壤根際微生物的數(shù)量和種類有關(guān)[26]。因此還有待于研究解磷菌最適生存環(huán)境和生長條件，為發(fā)揮解磷菌的作用，將其開發(fā)成微生物解磷菌肥提供數(shù)據(jù)支撐。