‘唐元韭黃’采后常溫貨架期致腐病原菌的分離與鑒定

王祖蓮，陳 晴，李煥秀，羅芳耀，朱永清，郭云建，高 佳*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；3.成都市郫都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和林業(yè)局，四川 成都 611730)

【研究意義】韭黃，百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)多年生草本植物，又名韭芽、黃韭芽等，是韭菜(A.tuberosumRottl. ex Spreng.)的宿根通過無光軟化栽培生產(chǎn)的一種特色蔬菜，其葉片黃白、質(zhì)地細(xì)嫩、香氣濃郁，在我國多地廣泛栽種[1]。韭黃富含豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及揮發(fā)性硫化物，具有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值，用于食療有溫中、行氣、散血、解毒等功效[2-3]。四川韭黃栽培歷史悠久，其中成都市郫都區(qū)唐元鎮(zhèn)被譽(yù)為“四川省韭黃之鄉(xiāng)”[4]，‘唐元韭黃’更是被授予國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品稱號(hào)，遠(yuǎn)銷國內(nèi)外?！圃曼S’葉片生長較長，通常可達(dá)60～80 cm，質(zhì)地脆嫩，含水量高，采后呼吸代謝旺盛，商品化處理和貯運(yùn)過程中易受機(jī)械損傷，造成葉片折斷破損，夏季高溫下放置2～3 d就會(huì)產(chǎn)生萎蔫、軟化、腐爛、霉變等現(xiàn)象，極大地限制了產(chǎn)品的銷售半徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外關(guān)于韭黃采后研究的報(bào)道較少，集中在采用丙二醛[1]、二氧化氯[5]、1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)[6]等不同的化學(xué)保鮮劑或保溫箱[7]等物理設(shè)施來延長產(chǎn)品貨架期上，而關(guān)于導(dǎo)致韭黃采后由病原菌引起的腐損關(guān)注較少。韭黃種植過程中需要對韭菜宿根進(jìn)行避光覆蓋軟化栽培，高溫、高濕環(huán)境下田間攜帶的病原菌種類和數(shù)量較多。研究顯示韭黃種植過程中發(fā)現(xiàn)的由煙草疫霉寄生變種交配型A1(Phytophthoranicotianaevar.parasitica)引起的韭黃爛葉病[8]，也有研究報(bào)道韭菜種植過程中發(fā)現(xiàn)了黃葉病(草生歐文氏菌菠蘿變種Erwiniaherbicolavar.ananas)[9]、綿疫病(樟疫霉PhytophthoracinnamomiRand)[10]、白絹病(SclerotiumrolfsiiSacc.)[11]、灰霉病(蔥鱗葡萄孢菌BotrytissquamosaWalker)[12]、根腐病(鐮孢菌Fusarium)[13]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】韭黃采前病害的種類受種植環(huán)境與栽培條件影響較大，采前病害與采后病害有相關(guān)性也存在差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本文以‘唐元韭黃’為研究對象，初步分離鑒定了導(dǎo)致韭黃采后腐爛的主要病原菌，以期為探明四川地區(qū)韭黃采后致腐病原菌種類提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病害調(diào)查及病原菌分離、純化和保藏 2018年9月，采集四川省成都市郫都區(qū)唐元鎮(zhèn)青楊韭黃專業(yè)合作社的新鮮無病癥的葉片，置于常溫[(20±0.5) ℃]下72 h，后調(diào)查病害發(fā)生情況，并描述病害癥狀。

致病病原菌分離于貯藏過程中具典型發(fā)病癥狀的韭黃葉片上，在無菌操作臺(tái)上純化菌株，分離培養(yǎng)溫度分別為30 、37 ℃，分離好的菌株防置于4 ℃的冰箱進(jìn)行短期貯藏。

1.1.2 化學(xué)試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA,北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；革蘭氏染色料(杭州微生物試劑有限公司)；香柏油分析純(中國上海懿洋有限公司)；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；瓊脂糖(上海玉博生物科技有限公司)；氯化鈉、無水乙醇等常規(guī)試劑為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.3 設(shè)備儀器 高壓滅菌鍋MM400[致微(廈門)儀器有限公司]；生物安全柜ESCD class Ⅱ BSC AC 2-6S1[新加坡藝思高科技有限公司]；恒溫培養(yǎng)箱LRHS-150-Ⅱ(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；顯微鏡OLYMPUS CX41RF[奧林巴斯(中國)有限公司]；PCR儀FlexCycle(德國耶拿分析儀器股份公司)；冷凍離心機(jī)5424[Eppendorf (中國)有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致腐病原菌的分離與純化 (1)致腐病原菌的分離。常溫貯藏的發(fā)病韭黃，經(jīng)無菌水清洗后于濾紙上晾干，采用組織分離法[14]，將分離的韭黃感病組織置于PCA及PDA培養(yǎng)基上，于37 ℃或30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

(2)致腐病原菌的純化。PDA培養(yǎng)基：待分離的病原真菌菌落生長至直徑1 cm時(shí)，切取菌落外端菌絲與培養(yǎng)基相接觸的菌塊，挑取菌塊放置在新的PDA培養(yǎng)基上重新培養(yǎng)，以上步驟重復(fù)3次。

PCA培養(yǎng)基：采用點(diǎn)接法[15]進(jìn)行純化備用。

1.2.2 致病性鑒定 對接種點(diǎn)采用“針刺”和“不處理”2種方式將分離的純培養(yǎng)物接種于健壯的韭黃葉片上，25 ℃下培養(yǎng)3～5 d，待發(fā)生腐爛現(xiàn)象后，從腐爛處分離致腐病原菌，與自然發(fā)病的癥狀進(jìn)行比較，并通過韭黃產(chǎn)生病害的發(fā)展速度和發(fā)展程度，評價(jià)其病原菌對韭黃的致病能力[16]。

1.2.3 致腐病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 (1)致腐病原菌的形態(tài)學(xué)特征觀察。將分離出的真菌和細(xì)菌分別接種于PDA及PCA培養(yǎng)基上，放置于37 和25 ℃下培養(yǎng)5～7 d，記錄菌落形態(tài)特征和顏色。

(2)致腐病原菌的顯微特征觀察。將培養(yǎng)好的真菌直接制片，細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后制片，在顯微鏡下觀察，記錄其特征。

1.2.4 致腐病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將韭黃采后主要致腐病原菌分別置于PDA和PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并純化得到單一菌株，在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)3～5 d，采用上海生工真菌、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(Ezup柱式)分別提取DNA。rDNA ITS擴(kuò)增分別采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以及細(xì)菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(16S rDNA)通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序參考試劑盒說明。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，然后送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序，通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST軟件與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行同源性比較，再利用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病表現(xiàn)癥狀及發(fā)病特點(diǎn)

將韭黃放置在常溫(25±0.5)℃下貯藏，3～5 d就會(huì)出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象(圖1)。韭黃白霉(圖1-a)多從萎蔫葉片上發(fā)病，先產(chǎn)生大量白色菌絲，后逐步擴(kuò)散導(dǎo)致周圍葉片迅速萎蔫失去商品價(jià)值。黑斑癥狀(圖1-b)，以韭黃莖受害為主，初期呈針尖狀褐色小斑，后逐漸擴(kuò)散呈明顯的黑色斑點(diǎn)，有的病斑后期會(huì)產(chǎn)生白色的霉?fàn)钗?，?dǎo)致貯藏后期韭黃莖商品性降低并軟化易折損。

黑斑病是農(nóng)作物的主要真菌性病害之一，在百合科植物上也較常見，石蘊(yùn)璉等[17]對蒜薹貯藏期黑斑病研究表明，其初期癥狀呈“針尖狀”小黃斑，少數(shù)中間凹陷，病斑產(chǎn)生褐色或黑褐色霉?fàn)钗?，其病原微生物?jīng)鑒定為匐柄霉{StemphyliumbotryosumWallr.[st.perf.=Pleosporaherbarum(Fr.)Rabenh.]}。水爛癥狀(圖1-c)是引起韭黃商品性劣變的主要病害現(xiàn)象之一，主要發(fā)生在韭黃葉片上。發(fā)病時(shí)先從幼嫩葉片邊緣產(chǎn)生水浸現(xiàn)象，1～2 d后迅速擴(kuò)散至整葉乃至整株植株，并伴隨著大量組織粘液的滲出和刺激性不良?xì)馕懂a(chǎn)生，莖稈和葉片軟腐。現(xiàn)有研究關(guān)于韭黃采后病害報(bào)道較少，尚未查見有關(guān)水爛癥狀的描述，但在韭菜田間栽種時(shí)有報(bào)道過類似的一種暗褐色水漬狀真菌病斑，其病部出現(xiàn)白色霉層，易引起葉片下垂腐爛，病原微生物經(jīng)鑒定為疫霉屬(Phytophthora)真菌[18]；此外也有報(bào)道在當(dāng)歸的田間種植時(shí)出現(xiàn)“水爛病”，其癥狀為葉基部呈水漬狀，然后萎蔫導(dǎo)致整個(gè)植株地上部分枯死，地下根腐爛，病原微生物經(jīng)鑒定為熒光假單胞桿菌第2生物型(Pseudomonas fluorescens 生物型Ⅱ)[19]。

2.2 室內(nèi)回接表現(xiàn)癥狀及致腐病原菌的鑒定

2.2.1 致腐病原菌的分離和純化 從出現(xiàn)先病癥的韭黃樣品中分別對“水爛”、“白霉”以及“黑斑”分別取樣分離，然后根據(jù)平板上的菌落特征對分離的致腐病原菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，分離得到1株細(xì)菌和1株真菌。

2.2.2 致腐病原菌的確定 依柯赫氏法則[16]將分離的1株細(xì)菌和1株真菌分別接種到新鮮健康的韭黃上進(jìn)行致病力鑒定，初步確定這2種病原菌具有較強(qiáng)的致病力，分別編號(hào)為j-1、j-2。重新將這2株菌接種到新鮮健康的韭黃莖稈上，再次從接種后腐爛的韭黃組織分離致腐病原菌，純化培養(yǎng)得到與j-1和j-2形態(tài)相似的病原菌。

將分離到的菌株分別采用“有傷”和“無傷”2種接種方式[20]回接到健康韭黃莖稈上，置于25 ℃室內(nèi)貨架存放3 d，觀察到接種j-1菌絲塊的韭黃莖全部發(fā)生腐爛現(xiàn)象，且有傷接種比無傷接種發(fā)病更快(圖2-a)；接種j-2細(xì)菌的韭黃莖在接種后5 d時(shí)，有傷接種的腐爛發(fā)生率超過80.00 %，但無傷接種未出現(xiàn)明顯癥狀，對照組也未發(fā)病(圖2-b)。將腐爛的韭黃再次進(jìn)行致腐病原菌的二次分離，得到與接種菌形態(tài)相同的致腐病原菌。根據(jù)柯赫氏法則[16]，證明j-1和j-2兩株接種菌都是導(dǎo)致韭黃腐敗的致腐病原菌，且與自然發(fā)病的癥狀相似；菌株毒力測定結(jié)果表明，j-1菌株的致病性比j-2菌株強(qiáng)。

a.韭黃葉片長霉癥狀；b.韭黃莖稈黑斑癥狀；c.韭黃水爛癥狀

a.j-1致病性鑒定；b.j-2致病性鑒定

2.2.3 致腐病原菌的鑒定 (1) 致腐病原菌形態(tài)特征的鑒定。j-1菌株為真菌，在PDA培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，直徑達(dá)60 mm左右。其菌落呈規(guī)則圓形(圖3)，同心圓紋狀，菌絲生長緊密，部分表生顏色為粉白色，部分埋生背觀顏色為粉色，隨著溫度濕度的變化，菌落顏色可能會(huì)發(fā)生改變。顯微鏡下，其菌絲為有隔菌絲，產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶梗，常產(chǎn)生大量的小型分生孢子大小為2.5～5.0 μm，呈腎形或卵形。未觀察到大型分生孢子和厚垣孢子。參考真菌形態(tài)特征系統(tǒng)分類的相關(guān)資料[21]，初步鑒定菌株j-1為鐮刀菌屬。

j-2菌株為細(xì)菌，在PCA培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)3～5 d后，菌落直徑達(dá)到1 cm左右(圖4)，菌落近乎圓形，邊緣呈鋸齒形，整個(gè)菌落外一圈近乎透明，且有光澤，而內(nèi)圈呈淡黃色凸起狀。經(jīng)革蘭氏染色(圖4-c，d)鑒定j-2為桿狀革蘭氏陰性菌，專性好氧菌。

a.j-1正面形態(tài)特征；b.j-1背面形態(tài)特征；c.j-1菌絲孢子特征；d.j-1孢子；e.j-1菌絲

a.j-2正面形態(tài)特征；b.j-2背面形態(tài)特征；c.光學(xué)顯微鏡下j-2的菌體形態(tài)；d.光學(xué)顯微鏡下j-2革蘭氏染色的菌體形態(tài)

a.j-1菌株；b.j-2菌株

(2) 致腐病原菌rDNA iTS及16S rDNA擴(kuò)增及序列分析。提取j-1菌株的DNA模板，利用引物ITS1和ITS4對j-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了500 bp左右的條帶(圖5)。對j-1進(jìn)行測序后，將所得到的序列使用NCBI上數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行比對分析(圖6)。結(jié)果表明，與j-1比對結(jié)果為100.00 %的菌株種類均為Fusariumoxysporum，其中同源性菌株的登錄號(hào)有MK192050.1、KY114145.1、KU939047.1、KU939046.1、KY775616.1、KX253980.1、KR7086 47.1、EU839382.1、EU839372.1和EU839365.1。結(jié)合j-1形態(tài)特征的觀察，最終確定其為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

提取j-2菌株的DNA模板，利用引物27F和1492R對j-2進(jìn)行擴(kuò)增得到1300 bp左右的條帶(圖7)。對j-2進(jìn)行測序后將所得到的序列結(jié)果在NCBI上的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析(圖6)，與j-2比對結(jié)果為97.90 %的菌株種類均為黃單胞桿菌屬(Xanthomonadales)的變形菌，其中具有遺傳相似性的菌株的登錄號(hào)有NR 157765.1、NR 121739.1、NR 028930.1、NR 116793.1、NR 148818.1、NR 116366.1、NR 117406.1、NR 136457.1、NR 025577.1和NR 134219.1；其中與登錄號(hào)為NR 157765.1的親緣關(guān)系最近(支持率為97.90 %)，其為嗜麥芽單胞菌(Stenotrophomonasbentonitica)，與登錄號(hào)為NR 025577.1以及NR 134219.1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合j-2形態(tài)特征的觀察，最終確定其為黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的一種嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。

圖6 j-1 rDNA ITS序列聚類圖

圖7 j-2 rDNA ITS序列聚類圖

3 討 論

由病原微生物引起的腐爛是造成果蔬采后腐損的主要原因之一，其中鐮刀菌屬微生物因廣泛存在于土壤和植物體內(nèi)，成為腐敗菌的重要來源[21-23]。Tonti等[24]的研究表明，鐮刀菌屬(Fusarium)是引起大蒜采后貯藏過程中腐爛的主要病原菌種類；李旭雙等[25]研究顯示，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和層生鐮刀菌(F.proliferatum)是導(dǎo)致大蒜出現(xiàn)水浸狀病斑的主要致病菌，病斑產(chǎn)生后逐步蔓延至整個(gè)蒜瓣，使蒜瓣呈現(xiàn)黃褐色和干縮現(xiàn)象。對洋蔥采后病害的分離鑒定表明[26]，引起洋蔥腐爛的主要病原微生物為曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和根霉屬(Rhizopus)4類，其中以曲霉屬和根霉屬為主。張軍高等[27]從貯藏期大蔥腐敗組織中分離鑒定出層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)、尖孢鐮孢菌(FusariumoxysporumSchlecht)和燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)3種致腐病原菌，其中層出鐮孢菌為大蔥鐮孢菌腐爛病的優(yōu)勢致病菌，分離頻率為52.50 %。此外，細(xì)菌性病害也是導(dǎo)致百合科蔥屬植物腐爛的主要原因之一。Tomlinson等[28]報(bào)道金黃色假單胞菌(Pseudomonascepaci)可以引起受傷的洋蔥球莖發(fā)生軟腐病；張鄭等[29]研究表明，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)會(huì)導(dǎo)致洋蔥鱗莖腐爛性病害的發(fā)生。

本試驗(yàn)從貨架貯藏過程中韭黃的“白霉水爛”和“黑斑”癥狀腐爛材料中分離出尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)致腐病原菌，與前人對大蒜干腐病[26]、洋蔥腐爛[25]等百合科蔥屬蔬菜采后病害的研究結(jié)果相似。但本試驗(yàn)在韭黃“水爛”癥狀植株上還分離鑒定出一株黃單胞桿菌的變形菌嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，該菌尚未在百合科蔥屬植物上有研究報(bào)道。有研究表明，黃單胞桿菌是造成油豆角貯藏期腐爛[30]和李細(xì)菌性穿孔[31]的主要致病病原菌。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)從韭黃常溫貨架貯藏過程中的腐爛植株中分離鑒定出2株致腐病原菌，分別編號(hào)為1株真菌j-1和1株細(xì)菌j-2。經(jīng)致病性鑒定表明，真菌j-1菌株對韭黃的致腐率達(dá)100.00 %，是導(dǎo)致韭黃腐爛的主要致腐病原菌；細(xì)菌j-2菌株對韭黃有傷接種的致腐率大于80.00 %，也是導(dǎo)致韭黃腐爛的重要致腐病原菌。對j-1和j-2菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征鑒定和rDNA的ITS序列分析，證明j-1菌株為鐮刀菌屬(Fusarium)中的尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)，j-2菌株為黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。