選擇性剪接與細(xì)胞凋亡

黎權(quán)文，李全忠

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西 桂林）

0 引言

凋亡定義為單個(gè)細(xì)胞破碎成膜結(jié)合顆粒，表現(xiàn)為DNA 片段化、胞質(zhì)和核濃縮、染色質(zhì)濃縮、凋亡小體形成，然后被特殊的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞吞噬。凋亡有助于機(jī)體去除感染、受損、老化或危險(xiǎn)的細(xì)胞，從而限制周圍組織的破壞，并維持組織的動(dòng)態(tài)平衡和器官的正常發(fā)育。凋亡的紊亂與自身免疫、慢性炎癥性疾病、腫瘤直接相關(guān)。

真核生物中，選擇性剪接（alternative splicing，AS）發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后，使單個(gè)基因產(chǎn)生一個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄本[1]。通過AS，同一基因產(chǎn)生的不同的mRNA 轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)翻譯形成的蛋白質(zhì)可能在結(jié)構(gòu)、功能、活性等方面存在明顯差異[2]。這種差異，造就了蛋白質(zhì)的多樣性及物種的復(fù)雜性。對AS 的研究逐漸深入，已經(jīng)從單個(gè)剪接事件發(fā)展到描述全局的剪接網(wǎng)，著重強(qiáng)調(diào)它們?nèi)绾芜M(jìn)行分子協(xié)調(diào)。現(xiàn)已確定，AS 有助于細(xì)胞分化、組織和器官發(fā)育[3]。而全基因組研究估計(jì)人類90-95%的基因經(jīng)歷不同程度的AS[3,4]。同時(shí)，前體mRNA 中順式作用的序列元件、反式作用的剪接因子或剪接體其他成分的突變引起人類多種疾病，進(jìn)一步凸顯了AS 的生物學(xué)重要性[5]。本綜述介紹AS 生理學(xué)基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制，同時(shí)還探討了AS 事件與凋亡的關(guān)系。

1 AS 的生物學(xué)基礎(chǔ)

真核生物基因序列中含有多個(gè)外顯子及內(nèi)含子，然而成熟的mRNA 只含有外顯子序列信息，這種將前體mRNA 剪接加工去除內(nèi)含子形成成熟mRNA 的現(xiàn)象稱為選擇性剪接（alternative splicing，AS）。剪接位點(diǎn)選擇的改變直接影響遺傳序列，導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列改變，最終將可能影響蛋白質(zhì)的變構(gòu)調(diào)節(jié)、酶活性或配體結(jié)合。剪接因子識別并結(jié)合順式作用調(diào)控序列，是建立和維持AS 的基本機(jī)制。這些順式作用調(diào)控序列包括外顯子增強(qiáng)子、外顯子沉默子、內(nèi)含子增強(qiáng)子和內(nèi)含子沉默子。剪接因子與順式作用調(diào)控序列的識別機(jī)制復(fù)雜而精密，大體上分為RNA-蛋白質(zhì)識別、RNA-RNA 識別和基因調(diào)控的特異性位點(diǎn)識別。

剪接體是一種高度動(dòng)態(tài)的核糖核蛋白復(fù)合體，由小的核糖核蛋白顆粒U1、U2、U4/U6 和U5 組成。它精密的組裝與分解直接影響剪接作用，是AS 的執(zhí)行者[6]。在識別剪接位點(diǎn)后，剪接體集合并組裝成剪接復(fù)合體完成AS，其機(jī)制主要包括：（1）剪接體U1、U2 與前體mRNA 上的剪接位點(diǎn)結(jié)合，并形成前剪接體復(fù)合體A[7]；（2）snRNP 將U4/U6、U5 轉(zhuǎn)運(yùn)至剪接位點(diǎn)，與前剪接體復(fù)合體A 形成前剪接體復(fù)合體B[8,9]；（3）U1、U4 脫離，U2、U5、U6 形成具有催化活性的剪接體復(fù)合物C[10,11]，最終執(zhí)行AS（圖1）。

2 AS 的調(diào)控

AS 受順式作用調(diào)控序列和反式作用因子。反式作用因子包括富含絲氨酸/精氨酸（SR）的蛋白家族、異源核糖核蛋白（hnRNPs）家族和組織特異性RNA 結(jié)合蛋白。反式作用因子識別并結(jié)合順式作用調(diào)控序列，促進(jìn)或抑制AS，是AS 的基本調(diào)控方式[12]。這些順式作用調(diào)控序列和反式作用因子的多重作用和作用機(jī)理已得到廣泛研究，但是實(shí)際上更為復(fù)雜。因?yàn)榧艚优c轉(zhuǎn)錄相關(guān)，并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的因子也直接影響AS[13]。其次，基因的轉(zhuǎn)錄與前體mRNA 的AS 存在時(shí)間及空間上的交錯(cuò)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄編碼形成mRNA 由RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，RNAPII）執(zhí)行。進(jìn)一步研究表明，RNAPII 在AS 中至關(guān)重要，其羧基端結(jié)構(gòu)域?qū)艚右蜃泳奂睫D(zhuǎn)錄位置是必不可少的[14]。RNAPII 的延伸速率直接影響轉(zhuǎn)錄過程中新生前體mRNA 的剪接位點(diǎn)和順式作用調(diào)控序列出現(xiàn)的速度。RNAPII 延伸減慢或暫停，有利于促進(jìn)外顯子包含；反之，則有利于促進(jìn)外顯子跳躍。最后，在基因轉(zhuǎn)錄過程中，核小體不可避免的阻礙RNAPII 的延伸，這種方式有利于剪接因子的識別并促進(jìn)外顯子包含[15]。組蛋白高乙?；c共轉(zhuǎn)錄剪接調(diào)控相關(guān)，其通過增加或減少剪接因子的募集而調(diào)控AS；同時(shí)組蛋白高乙?；蓪?dǎo)致局部RNAPII 延伸率增加，促進(jìn)外顯子跳躍。組蛋白標(biāo)記也可以對AS 造成直接的影響，因?yàn)槟承┙M蛋白修飾會(huì)通過染色質(zhì)結(jié)合蛋白募集剪接因子[16]。甲基結(jié)合域蛋白募集組蛋白修飾酶來改變周圍的染色質(zhì)，干擾RNAPII的延伸率。DNA 甲基化可能通過改變?nèi)旧|(zhì)或RNAPII 的延伸率影響AS。這些說明，表觀遺傳學(xué)也直接影響AS。

3 AS 與凋亡

3.1 剪接體核心成分與凋亡

mRNA 前體加工因子（pre-mRNA processing factor，PRPF）是剪接體核心成分。PRPF8 氨基酸序列437-770 結(jié)構(gòu)域結(jié)合U5[17]，同時(shí)羧基端激活U4/U6 的解旋酶[18]。PRPF8 突變引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)變性[19]。PRPF4 是U4/U6 的核心蛋白，能通過p38 MAPK 信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡[20]。PRPF3 與PRPF4相互作用，共同維持snRNP 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[21]。Comitato A 等研究發(fā)現(xiàn)，突變的PRPF3 聚集在核仁內(nèi)大的聚集物中，影響了SRSF2 的定位，觸發(fā)光感受器細(xì)胞的凋亡[22]。PRPF31 的突變促進(jìn)RHO 基因外顯子3 跳過，降低視紫紅質(zhì)的表達(dá)，并導(dǎo)致視紫紅質(zhì)陽性的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[23]。PRPF40B 定位于富含剪接因子的核斑點(diǎn)，與剪接因子SF1 和U2AF65 結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的剪接事件。PRPF40B 的缺失促進(jìn)Fas 外顯子6 的包含，導(dǎo)致長促凋亡Fas 亞型增加，膜結(jié)合Fas 受體增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。

3.2 剪接因子與凋亡

剪接因子主要由SR 蛋白家族和hnRNPs 蛋白家族組成。大多數(shù)SR 蛋白與剪接體結(jié)合促進(jìn)剪接體識別外顯子，從而促進(jìn)AS；而hnRNPs 與前體mRNA 的剪接位點(diǎn)結(jié)合，阻止剪接體識別剪接位點(diǎn)。SR 蛋白經(jīng)常與hnRNPs 結(jié)合，以濃度依賴的方式拮抗hnRNPs 的作用[25]。剪接因子3b 亞基1（splicing factor 3b subunit 1，SF3B1）是U2 復(fù)合體的一個(gè)組成成分。Zhang Q 等研究發(fā)現(xiàn)，SF3B1 是Tap73 的關(guān)鍵剪接因子，抑制SF3B1 表達(dá)能提高Tap73/DNp73 比列，并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[26]。hnRNA 蛋白K（Heterogeneous nuclear ribonucleo protein K ，hnRNPK）是MRPL33 前體mRNA 的關(guān)鍵剪接調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)MRPL33 外顯子3 包含，導(dǎo)致MRPL33-L 表達(dá)增加，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[27]。富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子/剪接因子2（Serine/arginine rich splicing factor/Splicing factor 2 ，ASF1/SF2）是序列特異性剪接因子。Iwanaga N 等使用促凋亡刺激物處理U937 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，caspase-2 前體mRNA 外顯子9 包含增加，導(dǎo)致caspase-2S/caspase-2L 的比例增加[28]。Jiang ZH 等研究表明ASF1/SF2、剪接因子SC35 促進(jìn)caspase-2 的外顯子9 跳躍，而hnRNP A1 促進(jìn)外顯子9 包含[29]。這表明ASF1/SF2、剪接因子SC35、hnRNP A1共同調(diào)節(jié)caspase-2 的AS，調(diào)控細(xì)胞凋亡。

3.3 凋亡基因的AS 與凋亡

凋亡是一種程序性細(xì)胞細(xì)胞，凋亡的激活表現(xiàn)為促凋亡基因的增加和抗凋亡基因的減少以及caspase 的激活，是一種規(guī)律的級聯(lián)反應(yīng)。然而，許多凋亡基因的AS 形成不同的亞型，它們在功能上常表現(xiàn)出拮抗作用。

Bcl-x 基因含有3 個(gè)外顯子，在外顯子2 中具有兩個(gè)5，剪接位點(diǎn)。Bcl-x 基因的AS 中，選擇了近端5，剪接位點(diǎn)，則會(huì)產(chǎn)生長的Bcl-xL 亞型；而選擇了遠(yuǎn)端5，剪接，則會(huì)產(chǎn)生短的Bcl-xS 亞型。Bcl-xL 具有233 個(gè)氨基酸，含有BH1、BH2、BH3 和BH4 結(jié)構(gòu)域。Bcl-xL 通過BH1、BH2 結(jié)構(gòu)域與線粒體膜結(jié)合，誘導(dǎo)與線粒體膜結(jié)合的Bax 向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，或者直接與Bax 結(jié)合，阻止了tBid 與Bax 結(jié)合，防止線粒體外膜持續(xù)開發(fā)以及細(xì)胞色素c 的釋放[30]。因此，Bcl-xL 通過抑制線粒體外膜持續(xù)開發(fā)來抑制細(xì)胞凋亡[31]。而Bcl-xS 與Bcl-xL 相比，缺少了63 個(gè)氨基酸區(qū)段，該區(qū)段包含保守的BH1 和BH2 結(jié)構(gòu)域。Bcl-xS 與Bcl-xL 形成異源二聚體，抑制Bcl-xL 的抗凋亡作用。多種剪接因子和信號通路影響B(tài)cl-xL/Bcl-xS 的剪接比，包括SR 蛋白、hnRNP、RNA 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。PUMA 有PUMA-α，-β，-δ 和-γ 四種不同的 剪 接 變 體[32]。PUMA-α 和-β 都 包 含BH3 域，而PUMA-γ 和PUMA-δ 沒有BH3 域。進(jìn)一步研究表明，PUMA-α 和-β 通過結(jié)合BAX 的BH3 結(jié)構(gòu)域，使線粒體外膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素c，從而介導(dǎo)線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]。Bnip3 是一種BH3-only蛋白。Bnip3 基因的AS 產(chǎn)生兩種剪接變體，分別為Bnip3FL 和Bnip3Δex3。Bnip3FL 同時(shí)具有BH3 和羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域，而Bnip3Δex3 兩者均缺失[34]。Bnip3FL 蛋白結(jié)構(gòu)中含有羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域，是Bnip3 進(jìn)入線粒體執(zhí)行促凋亡生物功能的基礎(chǔ)[35]。Bnip3Δex3 中缺少羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域，表明該剪接體無法將自身插入線粒體膜中。但是Bnip3Δex3 與Bnip3FL 結(jié)合形成同源二聚體，防止Bnip3FL 與線粒體膜結(jié)合[34]。凋亡基因的AS 受多種因素調(diào)控，包括細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外環(huán)境因素，其調(diào)控機(jī)理精密而復(fù)雜。以前，由于復(fù)雜的分析，較高的成本以及在較舊的、較不敏感的技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的假陽性結(jié)果，凋亡基因AS 調(diào)控的研究受到限制。但是，隨著測序成本的降低和二代測序的出現(xiàn)，凋亡基因AS 的調(diào)控機(jī)制將得到更深入的認(rèn)識。

4 總結(jié)

AS 是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵部分，受多種因素調(diào)節(jié)，參與真核生物的生長、發(fā)育、進(jìn)化。同時(shí)，細(xì)胞在各種病理或應(yīng)激狀態(tài)下，AS 作用導(dǎo)致基因組表達(dá)發(fā)生差異性改變以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。然而，AS 的調(diào)控不僅僅是單一的調(diào)控機(jī)制，而是復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)。凋亡是在各種病理或應(yīng)激狀態(tài)下以適應(yīng)機(jī)體需要而執(zhí)行的程序性細(xì)胞死亡，其與AS 相關(guān)的事件足以證明AS 與凋亡直接相關(guān)。因此，有必要進(jìn)一步闡明剪接調(diào)控網(wǎng)在凋亡中的級聯(lián)改變。深入了解凋亡的剪接調(diào)控網(wǎng)，將有可能開發(fā)出新的治療靶標(biāo)，為新的藥物研發(fā)提供新的思路。