右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用

李響，張雪薇，李莉，徐松齡，劉再英，袁曉環(huán)

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江 牡丹江；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江）

0 引言

當(dāng)供應(yīng)一個組織或器官的血液被阻斷時，快速恢復(fù)缺血區(qū)域的血流供應(yīng)為防止組織器官功能不可逆性損傷至關(guān)重要的挽救措施，然而，經(jīng)過重建等治療手段重新恢復(fù)向缺血組織輸送氧氣和營養(yǎng)時，將會增加單獨由缺血所造成的組織損傷，這種現(xiàn)象被稱為缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury, IRI)。右美托咪定是一種高選擇性的新型α2 腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗交感神經(jīng)和循環(huán)穩(wěn)定作用[1]?，F(xiàn)已證實，右美托咪定對腦、心肌、腎臟、肺和小腸等多種重要組織器官具有保護作用[2]。有研究報道，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)在肺缺血再灌注損傷的病理生理過程中均扮演著重要作用。本研究擬探討右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷后脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

小動物呼吸機（哈佛儀器公司，美國），右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國），超氧化物歧化酶試劑盒（南京建成生物功能研究所，中國），丙二醛試劑盒（南京建成生物功能研究所，中國），TNF-α ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，中國），IL-1β ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，中國）。

1.2 動物造模與方法

由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供SPF 級健康雄性成年SD 大鼠36 只，體重230-280g，采用隨機數(shù)字表法將其分為3組（n=12）：假手術(shù)組（Sham 組）、肺缺血再灌注組（IR 組）和右美托咪定預(yù)處理組（PD 組）。依照文獻[3]改良的Eppinger 方法建立肺缺血再灌注損傷模型，實驗前大鼠禁食8h，禁水4h，采用麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，左胸前區(qū)備皮消毒，氣管切開置入氣管導(dǎo)管，連接小動物呼吸機，設(shè)置呼吸機參數(shù)，呼吸頻率60次/min，潮氣量8-10mL/kg，吸呼比（I：E=1：2）。于胸骨左側(cè)第五肋間開胸，通氣30min 后，輕柔鈍性分離左肺門，經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)靜脈注入50U 肝素10min 后，IR 組和PD 組采用無創(chuàng)微血管夾夾閉左肺門，PD 組于術(shù)前30min 腹腔注射右美托咪定25ug/kg，三組大鼠均于缺血60min，再灌注120min 后股動脈放血處死大鼠，取左肺組織進行實驗。

1.3 肺組織濕干重比值的測定

取左肺上1/3 肺組織處理后稱重即為濕重（W），80℃恒溫烘箱中脫水，烘烤24h 后再次稱重即為干重（D），記錄每只大鼠肺組織濕/干重比值（W/D）。

1.4 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的測定

取左肺中1/3 肺組織冰凍后切片勻漿，離心后，取上清液制備10%肺組織進行勻漿，4℃，2000r/min，10min 離心取上清液，按照試劑盒說明書，采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法和化學(xué)比色法分別測定大鼠左肺組織中SOD 活性和MDA 含量。

1.5 瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素1β 的測定

取左肺下1/3 肺組織按體重體積比加入預(yù)冷生理鹽水做勻漿介質(zhì)，在冰水混合物條件下用1mL 旋轉(zhuǎn)勻漿器制成10%肺組織勻漿，4℃，3500r/min，10min 離心取上清液，按照試劑盒說明書，采用ELISA 法測定大鼠左肺肺組織中TNF-α 和IL-1β 的含量。

1.6 統(tǒng)計分析

采用GraphPadPrism 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕干重比值

與Sham 組比較，IR 組和PD 組大鼠左肺組織的W/D 比值升高(P＜0.05)；與IR 組比較，PD 組大鼠左肺組織的W/D 比值降低(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠肺組織W/D 比值的比較（n=12，

表1 三組大鼠肺組織W/D 比值的比較（n=12，

注: 與Sham 組比較，a P＜ 0.05 ; 與IR 組比較，bP＜ 0.05

檢測指標(biāo)Sham 組IR 組PD 組W/D 比值 2.61±0.31 7.6±0.53a 4.9±1.32ab

2.2 超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和髓過氧化物酶活性

與Sham 組比較，IR 組和PD 組左肺組織的MDA 含量升高，SOD 活性降低(P＜0.05)；與IR 組比較，PD 組左肺組織的MDA 含量降低，SOD 活性升高(P＜0.05)，見表2。

表2 三組大鼠肺組織SOD 活性和MDA 含量的比較（n=12，

表2 三組大鼠肺組織SOD 活性和MDA 含量的比較（n=12，

注: 與Sham 組比較，a P＜ 0.05 ; 與IR 組比較，bP＜ 0.05

檢測指標(biāo)Sham 組IR 組PD 組SOD（U/mg） 25.37±1.82 15.83±2.92a 20.63±1.34ab MDA（nmol/mg） 1.47±0.15 2.89±0.39a 1.95±0.21ab

2.3 瘤壞死因子-α 和白細(xì)胞介素1β

與Sham 組比較，IR 組和PD 組左肺組織的TNF-α 和IL-1β含量升高(P＜0.05)；與IR 組比較，PD 組左肺組織的TNF-α 和IL-1β 含量降低(P＜0.05)，見表3。

表3 三組大鼠肺組織TNF-α 和IL-1β 的比較（n=12，

表3 三組大鼠肺組織TNF-α 和IL-1β 的比較（n=12，

注: 與Sham 組比較，a P＜ 0.05 ; 與IR 組比較，bP＜ 0.05

檢測指標(biāo) Sham 組 IR 組PD 組TNF-α（pg/mg）213.27±39.43 775.52±93.92a 407.29±50.11ab IL-1β（pg/mg） 481.31±52.65 1316.09±151.83a926.75±122.47ab

3 討論

有研究表明，急慢性肺移植排斥反應(yīng)的發(fā)生都與移植術(shù)后缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)，肺移植中缺血再灌注損傷（Lung ischemia-reperfusion injury, LIRI）的發(fā)生率高達(dá)25%，而體外循環(huán)術(shù)后由LIRI 所致肺功能障礙的發(fā)生率仍高達(dá)15%-30%[4]。因此，胸外科手術(shù)術(shù)后肺功能的恢復(fù)是影響手術(shù)預(yù)后的關(guān)鍵因素。

缺血再灌注損傷的機制極其復(fù)雜，為了使肺損傷評價更加全面客觀，本研究同時觀察了MDA 含量和SOD 活性。再灌注損傷與活性氧(ROS)的形成、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性增加、中性粒細(xì)胞、血小板、細(xì)胞因子和復(fù)合系統(tǒng)的活化以及產(chǎn)生直接相關(guān)[5]。此外，ROS和其他自由基的增加在肺損傷的發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。ROS 在IRI 病理生理的重要性通過注射自由基清除劑或酶(包括SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)得到了證實，這些酶被認(rèn)為可以防止再灌注過程中所導(dǎo)致的損傷[5-6]。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化在缺血再灌注后的遠(yuǎn)端器官損傷中起重要作用。通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(MDA 含量)的生成速率來測定脂質(zhì)過氧化[7]。本研究結(jié)果顯示，與Sham 組相比，IR 組SOD 活性明顯降低，而MDA 含量顯著升高，表明肺缺血再灌注可造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。相比較而言，PD 組SOD 活性顯著升高，同時MDA 含量明顯降低，表明右美托咪定可抑制大鼠肺缺血-再灌注導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)的過度激活在肺缺血再灌注損傷的病理過程中起重要作用，可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤并釋放大量細(xì)胞因子，如TNF-α 和IL-1β 等細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致組織損傷[8-9]。TNF-α 和IL-1β 的過度表達(dá)可促使中性粒細(xì)胞聚集、趨化，增加血管通透性。形成肺間質(zhì)水腫，加重肺損傷。本研究結(jié)果顯示，右美托咪定可降低肺組織中W/D 的比值，抑制TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)，減輕肺水腫，使局部中性粒細(xì)胞浸潤減輕，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，右美托咪定能夠減輕大鼠肺缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。