急性升溫脅迫與恢復對葛氏鱸塘鱧抗氧化酶活性的影響

王博雅，郭 策，黃璞祎，柴龍會

( 東北林業(yè)大學 野生動物與自然保護地學院，黑龍江 哈爾濱 150040 )

葛氏鱸塘鱧(Perccottusglenii)為鱸形目、沙塘鱧科、鱸塘鱧屬魚類，在我國主要分布于黑龍江、遼河、圖們江等地區(qū)，具有廣溫性、耐缺氧等特點。近年來，由于過度捕撈、水質(zhì)污染及生態(tài)環(huán)境變化等原因，葛氏鱸塘鱧的自然資源量下降。目前，關(guān)于葛氏鱸塘鱧的研究剛剛起步，僅局限于養(yǎng)殖、人工繁殖、抗藥性等方面[1-3]，而關(guān)于溫度對葛氏鱸塘鱧抗氧化能力影響的研究未見報道。

在全球變暖的背景下，極端天氣的變化直接影響魚類的生存和生長[4]。水溫的變化會導致魚體的多種生理應(yīng)激反應(yīng)，使魚類代謝加速和能量需求增加，同時伴隨著活性氧自由基的過量產(chǎn)生[5-6]?；钚匝踝杂苫梢匝趸疍NA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，破壞分子的交聯(lián)作用，使酶活性降低，最終破壞細胞的完整性[7]。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶, 在清除自由基和機體免受損傷方面發(fā)揮重要作用, 能維持細胞和機體正常的生理活動[8]，因此抗氧化酶活性可作為衡量魚類對外界環(huán)境適宜程度的重要生理指標[9]。丙二醛是脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激的最終產(chǎn)物, 可以反映機體內(nèi)活性氧自由基含量和氧化應(yīng)激程度[7]。筆者研究了急性升溫脅迫對葛氏鱸塘鱧存活、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性及丙二醛濃度的影響,旨在探討急性升溫脅迫的適應(yīng)機制，為葛氏鱸塘鱧開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年9月，葛氏鱸塘鱧用地籠采自哈爾濱道外區(qū)民主濕地。魚體全長(10.15±1.33) cm，體質(zhì)量(13.41±6.31) g。試驗開始前，在實驗室暫養(yǎng)14 d。試驗容器為80 cm×60 cm×40 cm的玻璃水族箱，配置控溫、過濾和充氣設(shè)配。暫養(yǎng)水溫(17±1) ℃，溶解氧水平≥6 mg/L，日換水1/3。每日8:00和16:00各投喂冰凍搖蚊幼蟲1次，自然光照周期培養(yǎng)。

1.2 方法

選取規(guī)格相近、體表無傷、體質(zhì)健壯的試驗魚270尾，隨機分為3組：對照組、急性升溫組和漸變升溫組，每組設(shè)置3個平行，每個平行30尾，每組90尾。根據(jù)葛氏鱸塘鱧自然棲息環(huán)境中夏季的水溫變化范圍，將對照組溫度設(shè)定為17 ℃，急性升溫組和漸變升溫組的溫度上限設(shè)定為31 ℃，溫度變幅為±1 ℃。通過加熱棒及溫控儀控制，急性升溫組將試驗魚由17 ℃水族箱直接轉(zhuǎn)入31 ℃水族箱中，漸變升溫組的升溫速率為1 ℃/d，到達31 ℃時保持水溫恒定。試驗開始前24 h，停止投喂。

試驗開始后，對照組開始時取樣1次；急性升溫組升溫后1、6、12、24 h和恢復(17 ℃)后4 h和24 h共計取樣6次；漸變升溫組在達到31 ℃持續(xù)24 h后取樣1次。每組在各時間點取5尾，每個平行隨機取樣1～2尾。將試驗魚快速在冰盤上處死、解剖，取出肝臟、腦和肌肉置冰箱-80 ℃保存，待測。組織稱量質(zhì)量后，加入生理鹽水(1∶9)，低溫勻漿、離心后得到粗酶液。剩余試驗期間各組死亡個體及時取出并記錄死亡時間，以鰓蓋不運動、鑷子觸碰尾柄無反應(yīng)視為死亡。

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛濃度均采用南京建成生物研究所提供的試劑盒測定。超氧化物歧化酶采用黃嘌呤氧化酶法測定，超氧化物歧化酶活力單位定義：在反應(yīng)體系中超氧化物歧化酶抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為1個超氧化物歧化酶活力單位(U)；過氧化氫酶活力采用比色法測定，過氧化氫酶活力單位定義：每毫克組織每秒分解 1 μmol 雙氧水的量為1個酶活力單位(U)；谷胱甘肽過氧化物酶活力檢測采用分光光度計比色法，谷胱甘肽過氧化物酶酶活定義:每毫克組織在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽過氧化物酶濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位(U)；丙二醛濃度(mmol/mL)采用比色法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用Excel和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析(α=0.05)。不同處理組間采用Duncan方法進行多重比較，分析同一組織抗氧化酶活性和丙二醛濃度在對照、急性升溫(1、6、12、24 h)、恢復(4、24 h)和漸變中的顯著差異。不同處理組間死亡率采用獨立樣本t檢驗方法比較。

2 結(jié) 果

2.1 不同溫度處理組的葛氏鱸塘鱧在不同時間的死亡情況

葛氏鱸塘鱧死亡個體初始表現(xiàn)為口張大，鰓張大，呼吸明顯受阻，出現(xiàn)休克狀態(tài)，隨后死亡。急性升溫組在1 h時死亡率較高，隨著脅迫時間的延長，葛氏鱸塘鱧的死亡率逐漸降低，在脅迫12 h時，平行2死亡1尾，脅迫24 h時，3個平行均無死亡，組平均死亡率為(53.33±0.03)%。漸變升溫組3個平行均在24 h時有死亡情況，整個漸變升溫過程中平均死亡率為(5.56±0.02)%，顯著低于急性升溫組(P<0.05)。對照組和急性升溫組恢復過程均無死亡(表1)。

表1 升溫后不同時間各組葛氏鱸塘鱧的死亡情況

注：R表示恢復階段的試驗組.

Note: R represents the test group in recovery stage.

2.2 急性升溫和漸變升溫下葛氏鱸塘鱧肝臟的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

急性升溫至31 ℃ 1 h時，肝臟超氧化物歧化酶活性顯著低于17 ℃對照組(P<0.05)，1 h后呈升高趨勢，顯著高于漸變升溫組(P<0.05)；6 h后過氧化氫酶活性顯著高于對照組，直至24 h后顯著高于漸變升溫組；31 ℃急性升溫脅迫1 h時丙二醛濃度顯著高于對照組和漸變升溫組(P<0.05)，達到5.18 mmol/mL，在6、12 h時逐漸下降，24 h時升高(表2)。

恢復4～24 h時，急性升溫組超氧化物歧化酶活性顯著低于對照組和漸變升溫組(P<0.05)，過氧化氫酶活性與對照組相比顯著升高(P<0.05)；恢復24 h時丙二醛濃度顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 升溫后葛氏鱸塘鱧肝臟的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

注：表中同列數(shù)據(jù)右上角標相同字母的平均值間差異不顯著(P>0.05)，標不同字母的表示差異顯著(P< 0.05)；下同.

Note: the means with the same letter within the same column are not significant difference (P>0.05), and the means with different letters in the same column are significant difference (P<0.05); et sequentia.

2.3 急性升溫和漸變升溫下葛氏鱸塘鱧腦的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

急性升溫下1 h時腦中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性顯著低于17 ℃對照組(P<0.05)，1～12 h呈升高趨勢，但超氧化物歧化酶活性顯著高于漸變升溫組(P<0.05)；過氧化氫酶活性顯著低于漸變升溫組(P<0.05)；急性升溫下1 h時，腦中的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，后持續(xù)下降，但顯著高于漸變升溫組(P<0.05)；丙二醛濃度持續(xù)升高，在12 h時升至最高達到9.52 mmol/mL后降低，但顯著高于漸變升溫組(P<0.05)(表3)。

恢復條件下，超氧化物歧化酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，過氧化氫酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶活性在4 h時顯著高于對照組(P<0.05)，后急劇降低，顯著低于對照組(P<0.05)；丙二醛濃度在4 h時高于對照組，并呈升高趨勢。

2.4 急性升溫和漸變升溫下葛氏鱸塘鱧肌肉的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

31 ℃急性升溫脅迫條件下，肌肉中的超氧化物歧化酶活性上下波動，在12 h時活性最高，達到7.76U/mL，顯著高于漸變升溫組(P<0.05)；丙二醛濃度則在1.00～1.53 mmol/mL內(nèi)波動(表4)。

表3 升溫后葛氏鱸塘鱧腦的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

恢復4 h內(nèi)，超氧化物歧化酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，后逐漸升高，但未達到對照組活性水平；丙二醛濃度呈下降趨勢，最終與對照組濃度幾乎相同。

表4 升溫后葛氏鱸塘鱧肌肉的抗氧化酶活性和丙二醛濃度的變化

3 討 論

3.1 急性升溫和漸變升溫對葛氏鱸塘鱧死亡率的影響

魚類屬于變溫水生動物，水溫急劇升高和降低均會影響水生生物的存活和代謝[10]，若溫度驟升，耐寒魚類因不能適應(yīng)高溫環(huán)境而死亡[5]。本試驗結(jié)果顯示，葛氏鱸塘鱧對急性升溫應(yīng)激反應(yīng)明顯，在1 h內(nèi)死亡率較高；在漸變升溫的條件下，葛氏鱸塘鱧的死亡率很低，且是在變溫后過24 h開始死亡，這表明葛氏鱸塘鱧更能適應(yīng)漸變的升溫模式。該方式可使魚體有充足時間調(diào)節(jié)以適應(yīng)水溫變化[11]。葛氏鱸塘鱧為耐寒魚，對高溫的耐受能力較弱，所以在漸變升溫模式下，溫度達到魚的耐受極限也會導致其死亡。

3.2 急性升溫和漸變升溫對葛氏鱸塘鱧肝臟抗氧化酶活性和丙二醛濃度的影響

超氧化物歧化酶能將生物自身代謝或外界脅迫下產(chǎn)生的一系列有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為過氧化氫，再由過氧化氫酶將其還原成氧分子和水[12]，維持細胞和機體的正?；顒覽9]。Yang等[13-14]發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境溫度接近物種耐熱最佳溫度時，丙二醛濃度最低，當魚體暴露在臨界溫度上限時，丙二醛濃度顯著增加。

急性升溫脅迫1～24 h內(nèi)，葛氏鱸塘鱧肝臟中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性增加可能是低氧所致。高溫會降低水中的溶解氧水平，在缺氧的條件下，抗氧化酶活性和氧化應(yīng)激會增加。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下底棲麥瑞加拉鯪(Cirrinusmrigala)[15]肝臟中的超氧化物歧化酶活性增加。對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，急性升溫1 h內(nèi)，過氧化氫酶活性增加，這表明長時間的急性高溫脅迫給魚類帶來了缺氧的環(huán)境；在缺氧條件下，葛氏鱸塘鱧能通過增加抗氧化酶活性來增加機體防御能力和抵抗力，減少氧化損傷。而在漸變過程中，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性低于急性升溫組，也表明了漸變條件下氧化損傷更少，不需要大量的抗氧化酶來消除氧化損傷。

徐冬冬等[8]對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的研究發(fā)現(xiàn)，溫度恢復時超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均能恢復到對照組水平；但本試驗中，當溫度脅迫停止一段時間后，僅有過氧化氫酶的活性恢復到對照組水平，超氧化物歧化酶活性并未恢復到對照組水平。這可能是體內(nèi)的氧化還原壓力降低，使其肝臟內(nèi)的過氧化氫酶活性恢復，而超氧化物歧化酶活性可能由于高溫變性，不能恢復到原有活力[17]。

本研究中，在急性升溫1 h內(nèi)，葛氏鱸塘鱧肝臟中的丙二醛濃度較其他組織劇烈升高，顯著高于漸變升溫組。這表明肝臟是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生或氧化物分解的主要場所，急性升溫組比漸變升溫組積累的有害物質(zhì)更多。而急性升溫后1～12 h又迅速下降是因為抗氧化酶活性的增強消除了有害物質(zhì)。

3.3 急性升溫和漸變升溫對葛氏鱸塘鱧腦抗氧化酶活性和丙二醛濃度的影響

谷胱甘肽過氧化物酶能將脂質(zhì)過氧化物還原成醇，減少脂類被氧化的機會及丙二醛對細胞的損傷[18]。谷胱甘肽過氧化物酶以谷胱甘肽為底物通過化學方法降低過氧化氫和其他有毒化合物來減輕氧化應(yīng)激，與過氧化氫酶的功能類似，還可以清除脂質(zhì)過氧化物[5]。本試驗中，在急性升溫1 h內(nèi)，葛氏鱸塘鱧腦組織中的過氧化氫酶活性降低，谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著升高(P<0.05)，可能是由于過氧化氫酶的活力不足以清除過多的活性氧自由基及過氧化氫，因此機體調(diào)動谷胱甘肽過氧化物酶參與抗氧化的調(diào)節(jié)。過氧化氫酶活性在1 h后升高，谷胱甘肽過氧化物酶的活性開始下降，顯著低于對照組(P<0.05)，這與宋志明等[5]對點籃子魚(Siganusguttatus)的研究結(jié)果相同，可能是由于在急性升溫過程中，過氧化氫酶足以清除體內(nèi)過量的過氧化氫，抑制了谷胱甘肽過氧化物酶的活性，在漸變條件下，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性高于急性升溫組，而谷胱甘肽過氧化物酶活性低于急性升溫組，也表明漸變條件下氧化損傷較低，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶足以清除過氧化氫而抑制谷胱甘肽過氧化物酶的活性。

腦中超氧化物歧化酶活性在急性升溫1～12 h時顯著升高(P<0.05)，這表明高溫脅迫下腦組織超氧化物歧化酶活性的增加可能是清除超氧自由基的重要機制之一[19]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性增加，減少了活性氧的損傷，保持了相對的穩(wěn)態(tài)[20]。急性升溫12 h后腦中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性顯著降低(P<0.05)，推測這主要是由于在長時間高溫條件下魚體內(nèi)自由基增加較多，抗氧化酶活力不足以抑制細胞內(nèi)的氧化損傷，進而導致抗氧化酶活力下降?；謴瓦^程中，腦中的抗氧化酶除了過氧化氫酶外，最終也未達到對照組水平，而丙二醛濃度高于對照組。這表明長時間高溫導致魚體代謝紊亂，腦組織受到了損傷。

急性升溫12 h時，葛氏鱸塘鱧腦中的丙二醛濃度達到峰值，且顯著高于漸變升溫組，表明長時間急性高溫脅迫下，魚體腦代謝加快，脂質(zhì)過氧化程度比漸變條件下強，魚體通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性，使體內(nèi)脂質(zhì)過氧化氫含量降低。

3.4 急性升溫和漸變升溫對葛氏鱸塘鱧肌肉抗氧化酶活性和丙二醛濃度的影響

葛氏鱸塘鱧肌肉中的超氧化物歧化酶活性在急性升溫12 h時顯著升高(P<0.05)，這與對金頭鯛(Sparusaurata)[21]暖化后的氧化應(yīng)激代謝的研究結(jié)果相似，表明肌肉也具有較強的抗氧化能力。本試驗中肌肉的超氧化物歧化酶活性在急性升溫24 h時降低，說明長時間熱應(yīng)激使機體抗氧化能力減弱，削弱了機體的穩(wěn)態(tài)[20]?；謴瓦^程中，超氧化物歧化酶活性和丙二醛濃度均近乎恢復到對照組水平，說明肌肉組織相比于肝臟和腦更能適應(yīng)急性升溫，可能是由于肌肉大面積暴露在環(huán)境中，氧化應(yīng)激反應(yīng)更加迅速。漸變條件下，超氧化物歧化酶活性和丙二醛濃度均低于急性升溫組，說明漸變升溫與急性升溫相比對魚體的氧化損傷較小。