基于微生物指標評價冷凍熟制小龍蝦食用安全風(fēng)險

公方朔，陳一丹，楊 方，姜啟興，許艷順，夏文水

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

小龍蝦學(xué)名克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii），原產(chǎn)自美洲，20世紀30年代引進國內(nèi)[1]，因其環(huán)境適應(yīng)性強、繁殖能力旺盛[2]，且肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)價值高[3]，已逐步發(fā)展成我國重要的經(jīng)濟淡水蝦類[4]。目前我國小龍蝦產(chǎn)業(yè)以鮮銷為主，冷凍加工為輔[5]，由于生鮮小龍蝦容易腐敗變質(zhì)，且易受地域性和季節(jié)性等因素影響[6-9]，故大力發(fā)展小龍蝦的冷凍產(chǎn)品以實現(xiàn)跨地域、跨季節(jié)銷售，從而進一步帶動小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)品加工業(yè)經(jīng)濟的增長十分必要。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近5 年我國小龍蝦加工總量呈現(xiàn)穩(wěn)步增長趨勢，2021年加工總量約85萬 t，而養(yǎng)殖產(chǎn)量達263.36萬 t，是2016年的3 倍[10]。小龍蝦加工產(chǎn)業(yè)持續(xù)增長一方面促進了養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，另一方面也改善了地域性和季節(jié)性帶來的不利影響。近兩年受新冠病毒肺炎疫情的影響，預(yù)調(diào)味的冷凍熟制小龍蝦產(chǎn)品在各大電商平臺的銷量激增，深受廣大消費者喜愛[11]。然而，預(yù)調(diào)味的熟制小龍蝦為保證其獨有的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，通常采用較低強度的方式殺菌（如巴氏殺菌），由于小龍蝦的蛋白質(zhì)和水分含量較高，易被微生物利用而腐敗變質(zhì)[12]，而低強度殺菌不能完全消滅細菌的耐熱性孢子[13]，使得經(jīng)巴氏殺菌的產(chǎn)品必須貯藏在冷凍條件下，以抑制細菌生長繁殖，從而保證一定時間的貨架期。然而，當(dāng)這些冷凍產(chǎn)品在冷鏈溫度發(fā)生波動上升或者復(fù)熱升溫時間較長的情況下，沒有被殺滅的細菌會重新生長繁殖，造成食品腐敗變質(zhì)。在食品中，參與導(dǎo)致食品腐敗的微生物稱為腐敗菌[14]，冷凍熟制小龍蝦中的腐敗菌在凍藏過程中存活率有差異，有的腐敗菌耐受性高，可在適宜條件下復(fù)蘇使其數(shù)量逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位，稱為優(yōu)勢腐敗菌[15]。有效抑制小龍蝦產(chǎn)品中的優(yōu)勢腐敗菌可以進一步提高冷凍熟制小龍蝦的食用安全性，因此，鑒定冷凍熟制小龍蝦中優(yōu)勢腐敗菌對于小龍蝦產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，用于檢測食品中腐敗菌的技術(shù)層出不窮，高通量測序作為新一代測序技術(shù)，具有信息量大、效率高的優(yōu)點[16]。高通量測序并不需要對菌株進行分離培養(yǎng)[17]，它通過提取樣品中細菌總DNA、對原始DNA序列進行剪切過濾聚類等操作，獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），隨后進行的Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析可以顯示樣品間的差異，進一步的物種注釋及豐度分析可以深度展示樣品物種構(gòu)成，更加準確、全面地反映樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)[16]。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[18]，其中針對水產(chǎn)品，特別是針對探究小龍蝦腐敗菌相[19-23]的研究逐年增加。而目前對于冷凍熟制小龍蝦腐敗菌群多樣性的研究鮮有報道，且對于小龍蝦菌相的研究多集中于蝦肉，往往忽視了產(chǎn)品整體。整個熟制小龍蝦產(chǎn)品由多部分組成，不能僅從蝦肉菌相出發(fā)，需要結(jié)合不同部分綜合探討小龍蝦產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌。本研究選擇市售真空包裝冷凍熟制小龍蝦，通過不同部分理化指標的變化確定食用終點，并利用高通量測序技術(shù)對食用終點熟制小龍蝦的內(nèi)臟與鰓、蝦肉、蝦殼以及調(diào)味湯料的細菌菌群進行分析，找出優(yōu)勢腐敗菌，以期為開發(fā)優(yōu)質(zhì)冷凍熟制小龍蝦產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真空包裝冷凍熟制小龍蝦（750 g/盒），生產(chǎn)日期不超過30 d，購于天貓超市，冷鏈運輸至實驗室，置于－18 ℃冰箱保存。

鹽酸、硼酸、氧化鎂（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K9840自動凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LE483 pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；AX223ZH/E電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司：高速均質(zhì)機 湖南力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍熟制小龍蝦食用終點的確定

分別于距生產(chǎn)日期30、60、90、120、150、180 d取樣，每個時間點取3 個平行樣品，將樣品置于4 ℃冷藏柜中解凍12 h，解凍后用于總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值和pH值測定。

1.3.1.1 TVB-N值測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中自動凱氏定氮儀法，每30 d從冷凍真空包裝熟制小龍蝦中分別取5.00 g內(nèi)臟與鰓、蝦肉、蝦殼、調(diào)味湯料，攪碎后加入1.00 g氧化鎂，連接到自動凱氏定氮儀進行測定。

1.3.1.2 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》方法，每30 d從冷凍真空包裝熟制小龍蝦中分別取3.00 g內(nèi)臟與鰓、蝦肉、蝦殼、調(diào)味湯料，加30 mL煮沸后冷卻的水，使用高速均質(zhì)機將其均質(zhì)混勻，靜置30 min，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定pH值。

1.3.2 高通量測序

根據(jù)理化指標變化，無菌環(huán)境下取食用終點熟制小龍蝦樣品，分別于不同部分取樣，每個部分取15.00 g。參照Yu Dawei等[24]的方法提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化，構(gòu)建測序文庫。建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000測序平臺進行測序。測序結(jié)果首先使用Trimmomatic（version 0.33）、Cutadapt（version 1.9.1）軟件對序列進行質(zhì)控過濾得到優(yōu)化序列，然后使用USEARCH（version 10）、UCHIME（version 8.1）軟件進一步拼接過濾，最終得到高質(zhì)量的有效序列用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用USEARCH軟件對有效序列在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，使用QIIME2軟件，結(jié)合Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)數(shù)據(jù)，進行Alpha多樣性指數(shù)評估，基于分類學(xué)信息在門、屬水平上進行群落組成統(tǒng)計分析，同時借助R語言、Python語言工具在百邁客生物云平臺繪制物種豐度聚類熱圖。

使用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；利用SPSS 25軟件進行統(tǒng)計學(xué)顯著性差異分析，經(jīng)單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）后進行鄧肯多極差檢驗，P＜0.05表示有顯著性差異；利用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟制小龍蝦冷凍過程中TVB-N值和pH值的變化

TVB-N值是評判小龍蝦腐敗程度的重要指標之一，其是三甲胺、二甲胺、氨等揮發(fā)性胺類物質(zhì)含量的總和，主要由在微生物和酶的作用下降解蛋白質(zhì)及非蛋白的含氮化合物產(chǎn)生[25]。根據(jù)GB 10136—2015《食品安全國家標準動物性水產(chǎn)制品》規(guī)定，水產(chǎn)制品TVB-N值不得高于30 mg/100 g。由圖1可知，熟制小龍蝦在冷凍期間TVB-N值總體呈上升的趨勢，其中蝦殼和調(diào)味湯料增長趨勢較為緩慢，在整個貯藏期間TVB-N值均在安全限值以下；蝦肉和內(nèi)臟與鰓在凍藏期間TVB-N值持續(xù)增長，內(nèi)臟與鰓在貯藏前120 d增長趨勢較緩慢，由12.72 mg/100 g增加到17.84 mg/100 g，之后其數(shù)值快速增加，并在180 d時超過可接受上限，達到最大值（31.26 mg/100 g）。蝦肉在30～60 d貯藏初期以及150～180 d貯藏末期TVB-N值增速較快，在180 d時達到32.42 mg/100 g。

圖1 熟制小龍蝦不同部分凍藏期間TVB-N值變化Fig.1 Changes in TVB-N content of different parts of cooked crayfish during frozen storage

由圖2可知，相同貯藏時間熟制小龍蝦體系不同部分樣品間pH值具有顯著差異（P＜0.05），其中蝦殼和調(diào)味湯料呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這可能是由于貯藏前期蝦殼以及調(diào)味湯料中溶解的蛋白質(zhì)被降解，產(chǎn)生堿性小分子含氮化合物[9]，導(dǎo)致pH值上升；而貯藏后期乳酸、琥珀酸和磷酸等酸性物質(zhì)快速積累[26]，使pH值下降。而蝦肉、內(nèi)臟與鰓的pH值呈緩慢下降趨勢，始終處于弱堿性范圍。

圖2 熟制小龍蝦不同部分凍藏期間pH值變化Fig.2 Changes in pH of different parts of cooked crayfish during frozen storage

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1 測序樣本數(shù)據(jù)分析

所有樣本測序基本數(shù)據(jù)如表1所示，4 個樣品測序共獲得229 219 條原始序列，過濾后得到226 160 條優(yōu)化序列，進一步質(zhì)控、拼接、過濾長度和嵌合體后共產(chǎn)生217 214 條有效序列，有效序列平均長度為421～425 bp，并且樣品有效率在92.57%以上。將各樣品有效序列按照97%的相似度進行聚類，得到OTU。由表1可知，蝦殼OTU數(shù)量最多，為799；內(nèi)臟與鰓OTU數(shù)量次之，為711；調(diào)味湯料和蝦肉中OTU數(shù)量相對較少，分別為597和550。

表1 高通量測序樣本基本數(shù)據(jù)Table 1 Basic data of high-throughput sequencing

根據(jù)不同部分所對應(yīng)的OTU繪制維恩圖，利用維恩圖可以展示樣品之間共有、特有特征OTU數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣品間特征的重合情況，從而找出不同樣品中的共有微生物。如圖3所示，熟制小龍蝦4 個部分含有266 個相同OTU，內(nèi)臟與鰓、調(diào)味湯料、蝦殼以及蝦肉中獨有的OTU數(shù)分別為47、110、75、17，說明熟制小龍蝦不同部分細菌種類具有共性，但也存在一定差異。

圖3 熟制小龍蝦不同部分OTU的維恩圖Fig.3 Venn diagram of OTUs in different parts of cooked crayfish

2.2.2 熟制小龍蝦樣本Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標，包括Ace、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)等，其中Coverage指數(shù)越高，則樣本中物種被測出的概率越高。如表2所示，所有樣本測序的Coverage指數(shù)均大于0.99，即樣品覆蓋率高，序列未被檢出的概率低，表明所得有效序列可用于后續(xù)分析。

表2 熟制小龍蝦不同部分Alpha多樣性統(tǒng)計分析Table 2 Statistics of alpha diversity of bacteria in different parts of cooked crayfish

Chao1和Ace指數(shù)可用于衡量物種豐度（即物種數(shù)量），其數(shù)值越大，表明群落豐富度越高。如表2所示，調(diào)味湯料Chao1和Ace指數(shù)最大，蝦肉最小，表明調(diào)味湯料中菌群豐度最高，蝦肉中最低。

Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。相同物種豐度的情況下，群落中物種均勻度越高，則認為群落多樣性越高，Shannon指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性越高。表2顯示蝦殼Shannon指數(shù)最大，蝦肉最小，即蝦殼中細菌多樣性最高，蝦肉中最低。

圖4A為樣本稀釋曲線，可以用來判斷樣本測序量是否充分。隨著測序深度逐漸增加，各樣本稀釋曲線趨于平緩，結(jié)合覆蓋率數(shù)據(jù)，表明本研究測序結(jié)果可以反映熟制小龍蝦不同部分的微生物情況。圖4B等級-豐度曲線可以清晰反映出樣本中物種豐富度和均勻度，物種的豐富度由曲線在橫軸上的長度反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻度越高。由圖4B可以看出，4 個部分在橫軸上的分布長度由調(diào)味湯料、內(nèi)臟與鰓、蝦殼、蝦肉依次遞減，表明調(diào)味湯料細菌組成最為豐富，而蝦肉中物種豐富度較低。此外，調(diào)味湯料的曲線較平坦，表明其均勻度最高，而蝦肉和蝦殼的曲線較陡峭，表明其物種均勻度較低。

圖4 熟制小龍蝦不同部分樣品稀釋曲線（A）和等級-豐度曲線（B）Fig.4 Rarefaction curves (A) and rank-abundance curves (B) of bacteria in different parts of cooked crayfish

2.2.3 熟制小龍蝦不同部分腐敗微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

熟制小龍蝦不同部分腐敗菌群落門水平（豐度前10 位的菌種）組成如圖5A所示，其中內(nèi)臟與鰓、蝦肉和蝦殼中主要菌門為變形菌門（Proteobacteria），相對豐度分別為68.41%、74.77%和54.03%；其次為厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度為9%～22%；此外，擬桿菌門（Bacteroidetes）在蝦殼（14.58%）和內(nèi)臟與鰓（8.40%）中也占有一定比例。在調(diào)味湯料中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度為62.05%，變形菌門和擬桿菌門分別占19.78%和7.17%；其他菌門在各樣本中所占比例均小于5%。總體來看，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為冷凍熟制小龍蝦中的優(yōu)勢菌門，門水平上各部分細菌種類大致相同，但豐度具有較大差異。

圖5 熟制小龍蝦不同部分樣本細菌門水平（A）和屬水平（B）物種相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria in different parts of cooked crayfish at the phylum level (A) and genus level (B)

為了更深入了解熟制小龍蝦體系不同部分微生物多樣性差異，選取相對豐度前10 位的菌屬，探究屬水平上的微生物多樣性差異，結(jié)果如圖5B所示。不同樣本間的優(yōu)勢菌屬有較大差異，主要為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、弧菌屬（Vibrio）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等。內(nèi)臟與鰓中嗜冷桿菌屬占主要優(yōu)勢，為47.86%，弧菌屬（5.05%）也占有一定比例，而其他菌屬占比均小于5%；蝦肉中菌屬群落結(jié)構(gòu)和內(nèi)臟與鰓中相似，以嗜冷桿菌屬（42.31%）為主，還含有較多不動桿菌屬（16.04%），以及少量弧菌屬和Candidatus Arthromitus；調(diào)味湯料不同于以上兩個樣本，其含有大量的乳酸桿菌屬（46.25%）；蝦殼中優(yōu)勢菌屬組成豐富，以弧菌屬（21.72%）、乳酸桿菌屬（19.38%）和嗜冷桿菌屬（7.40%）為主。

選取豐度排名前50 位的菌屬，根據(jù)其在各樣本中的豐度信息進行聚類分析，顏色梯度由藍色到紅色表示菌屬在樣本中相對豐度由低到高。從圖6可以看出，熟制小龍蝦不同部分群落結(jié)構(gòu)具有較大差異。通過聚類分枝的長度可知，內(nèi)臟與鰓和蝦肉的菌屬結(jié)構(gòu)相似，調(diào)味湯料、蝦殼的菌屬結(jié)構(gòu)則相對獨立。

圖6 熟制小龍蝦不同部分樣本屬水平物種豐度聚類熱圖Fig.6 Clustering heatmap of bacterial abundance at the genus level of samples from different parts of cooked crayfish

2.2.4 熟制小龍蝦不同部分樣品菌群結(jié)構(gòu)差異分析

主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）是對特征值和特征向量進行排序，選擇主要排在前幾位的特征值，以找到距離矩陣中最主要的坐標，通過PCoA可以實現(xiàn)多個樣品的分類，進一步展示樣品間物種多樣性差異。如圖7所示，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）解釋度分別為60.62%和28.01%，疊加解釋度達88.63%。各樣本分散在4 個象限中，內(nèi)臟與鰓和蝦肉距離較近，表明其組內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)有相似之處，而其他兩組樣本相距較遠。因此，冷凍熟制小龍蝦中不同部分之間的微生物結(jié)構(gòu)差異較大。

圖7 熟制小龍蝦不同部分樣品菌群PCoAFig.7 PCoA of microbial communities in different parts of cooked crayfish

3 討論

本研究以市售冷凍真空包裝熟制小龍蝦為研究對象，通過理化指標變化確定了熟制小龍蝦在180 d時達到食用終點，利用高通量測序技術(shù)分析食用終點樣本中不同部分的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)熟制小龍蝦不同部分的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性具有差異。門水平上，內(nèi)臟與鰓、蝦肉、蝦殼、調(diào)味湯料4 個部分中菌群以厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主，先前的研究表明變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是熟制小龍蝦的核心菌群[27]。屬水平上，內(nèi)臟與鰓中主要為嗜冷桿菌屬以及少量弧菌屬。這是因為內(nèi)臟與鰓中的微生物與小龍蝦生長養(yǎng)殖環(huán)境有較大聯(lián)系，小龍蝦生長養(yǎng)殖環(huán)境較復(fù)雜，環(huán)境中的微生物隱藏在蝦鰓以及內(nèi)臟中，加工過程中簡單地清洗不能將其去除，進而使其出現(xiàn)在產(chǎn)品中。蝦肉和內(nèi)臟與鰓的菌群組成結(jié)構(gòu)相似，主要為嗜冷桿菌屬，但蝦肉中還有一定比例的不動桿菌屬。蝦肉中的主要微生物可能來源于其腸道[28]，小龍蝦在加工過程中造成腸道破裂，而蝦肉中蛋白含量較高，有利于微生物生長，從而使內(nèi)臟中的微生物轉(zhuǎn)移到蝦肉并逐步發(fā)展成優(yōu)勢菌。冷凍貯藏條件下，大部分微生物生命活動被抑制，經(jīng)過4 ℃解凍使可以在低溫條件下生長代謝的嗜冷桿菌屬、不動桿菌屬以及弧菌屬復(fù)蘇，并利用內(nèi)臟與鰓和蝦肉中的營養(yǎng)物質(zhì)生長代謝，逐步占據(jù)優(yōu)勢，而這3 種菌屬常見于低溫貯藏產(chǎn)品中[29-30]；調(diào)味湯料時常會被研究者們忽略，在凍藏-解凍期間，它的存在極大程度影響了樣品整體pH值，進而影響微生物群落。調(diào)味湯料初始pH值較低，利于乳酸桿菌屬代謝發(fā)育，并且真空包裝條件下，細菌有氧代謝受到抑制，而乳酸桿菌可進行厭氧代謝[31]，由于貯藏溫度波動上升，乳酸桿菌屬逐步在調(diào)味湯料中占據(jù)優(yōu)勢。蝦殼中優(yōu)勢菌群較豐富，主要由弧菌屬、乳酸桿菌屬和嗜冷桿菌屬組成。蝦殼作為連接蝦內(nèi)部和外部的關(guān)鍵點，其微生物來源較廣，包括內(nèi)部內(nèi)臟與鰓和蝦肉中菌群的向外擴散、生長加工環(huán)境中微生物的污染以及調(diào)味湯料中微生物的向內(nèi)擴散[32]；其中弧菌屬可能是由于小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境的污染和加工清洗不完全，使得環(huán)境中或者內(nèi)臟與鰓中的弧菌屬附著在蝦殼上，而弧菌屬作為兼性厭氧菌可在真空包裝條件下生存[31]，且后續(xù)加工條件以及較低強度的殺菌不能將其消滅，進而使其出現(xiàn)在產(chǎn)品中。由于蝦殼為小龍蝦分隔內(nèi)外的屏障，推測嗜冷桿菌屬和乳酸桿菌屬主要來源于內(nèi)臟與鰓和調(diào)味湯料。

小龍蝦的品種、生長環(huán)境、加工貯藏條件均會影響優(yōu)勢腐敗菌菌相結(jié)構(gòu)[33]，因此熟制小龍蝦制品在加工過程中，可結(jié)合超聲波等物理技術(shù)對小龍蝦進行多次復(fù)合清洗，降低初始菌落豐度；對于調(diào)味湯料，可以適當(dāng)延長煮制時間或調(diào)整湯料酸度；低強度殺菌雖然可以保留小龍蝦獨特的風(fēng)味，但具有一定局限性，可適當(dāng)結(jié)合使用抑菌劑以及其他物理殺菌方法，進而在保證產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的同時降低食用風(fēng)險，延長貨架期。本研究結(jié)果可為今后冷凍熟制小龍蝦制品食用安全性和品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。