核磁共振氫譜定量法分析樟樹籽油的甲酯化率

王云鵬 徐 華 楊德孟 樓喬明 張進杰 楊文鴿

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，寧波 315211)

樟樹(Cinnamomumcamphora)屬樟科屬常綠喬木植物，主要分布于我國的熱帶和亞熱帶地區(qū)，是樟屬植物中經(jīng)濟價值最大的樹種之一[1]。樟樹籽含油量高達40%以上，以甘油三酯為主，且脂肪酸主要為癸酸(C10∶0，51.49%)和月桂酸(C12∶0，40.08%)，其甲酯衍生物比C16和C18等長鏈脂肪酸具有更高的十六烷值、更好的運動黏度和氧化穩(wěn)定性，是制備脂肪酸甲酯的理想原料[2，3]。

目前，國內(nèi)外用于測定脂肪酸甲酯純度或產(chǎn)率的方法多以氣相色譜(GC)為主[4]，但GC定量過程煩瑣，且對不易揮發(fā)的高沸點物質(zhì)分析較難。同時，基于光譜技術(shù)建立的脂肪酸甲酯化率測量模型，前期均需測定大量樣品，耗時耗力且適用范圍較窄[5-7]；而黏度法、酸值法、質(zhì)量法、薄層層析法和分光光度法等方法，均因測定結(jié)果準(zhǔn)確度較低等原因，未能廣泛使用[8]。

核磁共振氫譜定量法(q1H-NMR)依據(jù)核磁共振峰的峰面積與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比的原理，通過內(nèi)標(biāo)法，可以直接測量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量；其分辨率高、準(zhǔn)確性強、操作簡便、分析速度快，已成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點。目前，q1H-NMR法在脂肪酸甲酯定量分析領(lǐng)域應(yīng)用較少，國內(nèi)外鮮有報道。因此本研究以月桂酸甲酯和甘油三月桂酸酯標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，對其核磁共振氫譜進行分析，確定定量峰的峰面積與混合標(biāo)準(zhǔn)品中月桂酸甲酯含量之間的定量關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用于樟樹籽油衍生過程中甲酯化率的測定，以期為樟樹籽油甲酯化率的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹籽、氘代三氯甲烷(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%四甲基硅烷)、月桂酸甲酯、甘油三月桂酸酯和十三烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品；三氯甲烷、氫氧化鉀、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉等分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE III HD 500 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀；7890A型氣相色譜儀；M7-80EI型質(zhì)譜儀；RV-10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；XO-5200DTD超聲波清洗儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 樟樹籽預(yù)處理

將樟樹籽于50 ℃烘箱干燥至恒重，去殼粉碎，經(jīng)40目過篩，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 油脂提取

采用Folch法[9]提取樟樹籽油。稱取 20 g樟樹籽仁粉末，用400 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1，V∶V)混合液超聲 30 min(功率250 W，頻率40 kHz，溫度25 ℃)，并浸提24 h；過濾后，濾液用 80 mL 0.9%氯化鈉溶液洗滌，靜置分層后，收集三氯甲烷層，用無水硫酸鈉干燥，經(jīng)減壓濃縮，得樟樹籽油。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制

分別取0、10、20、30、40、50 mg(精確至0.1 mg)月桂酸甲酯加入甘油三月桂酸酯中，使混合標(biāo)準(zhǔn)品總質(zhì)量為50 mg，即月桂酸甲酯在混合標(biāo)準(zhǔn)品中所占質(zhì)量百分含量分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%。用0.6 mL氘代三氯甲烷溶解，并轉(zhuǎn)移至核磁管中，用于核磁共振氫譜分析。

1.3.41H-NMR譜分析

氫譜參數(shù)：脈沖序列zg30，檢測溫度為298.0 K，90°脈沖寬度P1為11.11 μs，譜寬SWH為10 000 Hz，脈沖延遲時間D1為1 s，采樣點數(shù)TD為65 536，采樣時間at為3 s，掃描次數(shù)NS為16，空掃DS為2。使用MestReNova軟件對圖譜進行處理和分析。

1.3.5 q1H-NMR的定量關(guān)系

根據(jù)公式(1)確定本實驗中q1H-NMR的定量關(guān)系[10，11]，以混合標(biāo)準(zhǔn)品中月桂酸甲酯的含量(%)為X軸，1H-NMR定量峰的峰面積(以內(nèi)標(biāo)峰為參照)為Y軸，建立一元線性回歸方程。

(1)

式中：S1和S2分別為待測樣與內(nèi)標(biāo)峰的積分面積；N1和N2分別為待測樣與內(nèi)標(biāo)物定量峰積分信號所包含的質(zhì)子數(shù)；M1和M2分別為待測樣與內(nèi)標(biāo)物的相對分子質(zhì)量；m1和m2分別為待測樣與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；P1和P2分別為待測樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量百分含量。

1.3.6 堿法甲酯化衍生[12]

取100 mg樟樹籽油，加入3 mL 1 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，振蕩反應(yīng)(0、0.1、0.5、1、3、5、10 min)，依次加入1 mL 飽和氯化鈉溶液和2 mL 正己烷，振蕩后6 000 r/min離心3 min，取正己烷層，重復(fù)正己烷萃取3次，合并正己烷相，減壓濃縮后，用于1H-NMR和GC-MS分析。

1.3.7 GC-MS分析[13-14]

以十三烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，進行定量分析，以測定樟樹籽油的甲酯化率。色譜條件：DB-WAX 毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；進樣量1.0 μL，分流比50∶1；以氦氣為載氣，載氣流量1 mL/min；溶劑延遲時間為3 min。質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250 ℃，EI離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：m/z50～650 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 1H-NMR譜歸屬和定量峰確定

甘油三月桂酸酯和月桂酸甲酯的核磁共振氫譜見圖1，參考Nieva等[15，16]對信號峰進行歸屬，結(jié)果列于表1。甘油三月桂酸酯與月桂酸甲酯結(jié)構(gòu)上的差異，致使兩者在核磁共振氫譜中具有各自的特征峰[17]。由表1可知，化學(xué)位移δ=4.13～4.18和δ=4.28～4.34譜峰歸屬為甘油骨架中亞甲基上的氫(—CH2—CH—CH2—)，可作為甘油三月桂酸酯的特征峰；δ=3.67譜峰為脂肪酸甲酯中的甲氧基上的氫(—OCH3)，可作為月桂酸甲酯的特征峰；此外，δ=5.25～5.30處的多重峰歸屬為甘油骨架中的次甲基上的氫(—CH2—CH—CH2—)，也可作為甘油三月桂酸酯的特征峰。

圖1 甘油三月桂酸酯a和月桂酸甲酯b的核磁共振氫譜圖

用于定量分析的特征峰通常優(yōu)先選擇與相鄰峰分離度好、無干擾信號的峰，且最好為含多個氫質(zhì)子的單峰[18]。由圖1可知，δ=5.25～5.30處的譜峰雖為特征峰，但含氫少，且為多重峰，分離度較差，因此不宜作為定量峰；而δ=4.13～4.18、δ=4.28～4.34和δ=3.67兩組信號峰與其他峰完全分開，含氫較多，峰型對稱，峰兩側(cè)基線平坦，無干擾，因此可作為定量分析的特征峰。

表1 信號峰的化學(xué)位移及官能團歸屬

注：s，單峰；t，三重峰；q，五重峰；m，多重峰；dd，雙峰+雙峰。

2.2 1H-NMR法線性關(guān)系的確定

分別以月桂酸甲酯中的甲氧基(—OCH3)和甘油三月桂酸酯中甘油骨架上的亞甲基(—CH2—CH—CH2—)作為定量峰進行線性關(guān)系的確定，定量峰和內(nèi)標(biāo)峰的核磁共振氫譜見圖2。

圖2 —OCH3(a)和—CH2—CH—CH2-(b)與Si(CH3)4的核磁共振氫譜局部放大圖

由圖3a可知，隨著樣品中月桂酸甲酯含量的增加，—OCH3信號峰(δ=3.67)強度也隨之增大，二者成正比關(guān)系。將四甲基硅烷[Si(CH3)4]的甲基信號峰(δ=0.008)峰面積標(biāo)定為1，獲得—OCH3信號峰的峰面積，根據(jù)定量式(1)，以混合標(biāo)準(zhǔn)品中月桂酸甲酯含量為橫坐標(biāo)，—OCH3信號峰的峰面積為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸分析，得到線性回歸方程y=-0.97+0.61x，R2=0.999 1(圖3b)。結(jié)果表明，以—OCH3信號峰為定量峰時，定量峰的峰面積與月桂酸甲酯含量具有良好的線性關(guān)系，可用于月桂酸甲酯的定量分析。

圖3 不同月桂酸甲酯含量樣品中—OCH3信號峰a及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線b

由圖4a可知，隨著樣品中月桂酸甲酯含量的增加，—CH2—CH—CH2—信號峰(δ=4.13～4.18和δ=4.28～4.34)強度在逐漸降低，二者成反比關(guān)系。將Si(CH3)4的甲基信號峰(δ=0.008)峰面積標(biāo)定為1，獲得—CH2—CH—CH2—信號峰的峰面積，根據(jù)定量式(1)，以—CH2—CH—CH2—信號峰的峰面積與混合標(biāo)準(zhǔn)品中月桂酸甲酯含量建立校準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=34.6-0.35x，R2=0.999 8(圖4b)。結(jié)果表明，以—CH2—CH—CH2—信號峰為定量峰時，定量峰的峰面積與月桂酸甲酯含量具有良好的線性關(guān)系，亦可用于月桂酸甲酯的定量分析。

圖4 不同月桂酸甲酯含量樣品中—CH2—CH—CH2—信號峰a及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線b

圖5 樟樹籽油不同衍生時間產(chǎn)物的核磁共振氫譜圖

2.3 樟樹籽油甲酯化率測定

樟樹籽油經(jīng)1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液不同時間的甲酯化衍生，其核磁共振氫譜見圖5。從圖5可知，隨著衍生時間增加，甘油三酯中的—CH2—CH—CH2—信號峰(δ=4.13～4.18和δ=4.28～4.34)強度逐漸減弱，而脂肪酸甲酯中的—OCH3信號峰(δ=3.67)強度逐漸增強；當(dāng)衍生時間為10 min時，—CH2—CH—CH2—信號峰完全消失，而—OCH3信號峰達到最大值，表明隨著衍生時間的增加，樟樹籽油中的甘油三酯逐漸轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，這與Anderson等[19]報道的結(jié)果一致。

采用q1H-NMR法對樟樹籽油不同衍生時間的甲酯化率進行定量分析，并與GC-MS法進行比較，結(jié)果列于表2。由表2可知，以—OCH3和—CH2—CH—CH2—為定量峰的兩種q1H-NMR法所測結(jié)果基本一致。當(dāng)衍生時間為0.1 min時，樟樹籽油甲酯化率僅為6.0%；并隨著衍生時間的增加，甲酯化率逐漸增加；當(dāng)衍生時間為5 min時，甲酯化率達到87.6%；而當(dāng)衍生時間為10 min時，樟樹籽油甲酯化幾乎完全，甲酯化率達到99.1%。將q1H-NMR法所測結(jié)果與GC-MS法進行t檢驗，結(jié)果顯示無顯著性差異(P>0.05)，因此q1H-NMR法能有效用于樟樹籽油甲酯化率的分析，且具有前處理簡單、分析時間短、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點。

表2 不同衍生時間樟樹籽油的甲酯化率/%

3 結(jié)論

將月桂酸甲酯的特征峰(δ=3.67)和甘油三月桂酸酯的特征峰(δ=4.13～4.18和δ=4.28～4.34)作為定量峰，以混合標(biāo)準(zhǔn)品中月桂酸甲酯含量(%)為X軸，定量峰相對峰面積(內(nèi)標(biāo)峰為參照)為Y軸，得到甲氧基(—OCH3)峰面積與月桂酸甲酯含量的線性回歸方程為y=-0.97+0.61x(R2=0.999 1)；甘油骨架亞甲基(—CH2—CH—CH2—)峰面積與月桂酸甲酯含量的線性回歸方程為y=34.6-0.35x(R2=0.999 8)；兩者均具有良好的線性相關(guān)系數(shù)，可用于脂肪酸甲酯的定量分析。

采用核磁共振氫譜定量法對樟樹籽油衍生過程中甲酯化率進行測定，以—OCH3和—CH2—CH—CH2—為定量峰，兩種定量法所測結(jié)果基本一致。樟樹籽油的甲酯化率隨著衍生時間的增加而逐漸增加，當(dāng)衍生時間為10 min時，樟樹籽油甲酯化率達到99.1%。q1H-NMR法所測結(jié)果與GC-MS法無顯著性差異(P>0.05)，表明q1H-NMR法能有效用于樟樹籽油甲酯化率的分析測定，且具有前處理簡單、分析時間短、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點。