17β-雌二醇對(duì)rBMSCs肝祖細(xì)胞定向分化及Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用

曾令鋒 黃俊宇 熊瑤 張志東 王景浩 黃碩 韋宏成★

人工肝支持系統(tǒng)（artificial liver support system，ALSS）作為替代肝臟功能的治療方法，可暫時(shí)延緩或維持晚期肝臟疾病患者的生命，包括非生物型、生物型以及混合型。研究表明，生物型人工肝通過穩(wěn)定的體外培養(yǎng)肝細(xì)胞生物反應(yīng)器，發(fā)揮肝細(xì)胞多種功能，能明顯降低病死率，是未來人工肝發(fā)展的方向［1-2］。因此，如何在體外獲得穩(wěn)定的肝細(xì)胞源，是人工肝技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可直接分化成肝細(xì)胞，降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并刺激肝細(xì)胞功能的修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等方式，從而改善肝功能，減緩肝硬化進(jìn)程。另外，研究表明［3-6］，雌激素對(duì)肝硬化具有保護(hù)作用。目前，BMSCs肝向分化的機(jī)制和雌激素是否影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat Bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）肝向分化均尚不清楚。本研究通過體外誘導(dǎo)rBMSCs定向分化成肝祖細(xì)胞，探討17β-雌二醇（17β-estradiol，17β-E2）對(duì)rBMSCs肝祖細(xì)胞向分化的影響及其潛在作用機(jī)制，驗(yàn)證17β-E2是否通過調(diào)控Wnt 信號(hào)通路影響rBMSCs肝祖細(xì)胞向分化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

rBMSCs由暨南大學(xué)腫瘤研究所捐贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM 培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone）；成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基、D-Hanks 平衡鹽緩沖液（廣州PanEra）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（天津?yàn)螅?.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco）；17β-雌二醇（西安嘉博盈）；CCK-8 試劑盒（北京Dojindo）；CD29 抗體、CD45 抗體、CD80 抗體、CD90 抗體（美國(guó)Biolegend）；Tris-HCL（pH 8.3））（北京索萊寶）；β-Catenin 蛋白抗體、Wnt3a 蛋白抗體、LRP-5 蛋白抗體、GAPDH 蛋白抗體、WB 一抗稀釋液（美國(guó)CST）。單人雙面凈化工作臺(tái)（上海一恒SW-CJ-IF）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific3111 型）、低速/高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf Centrifuge 5702）、倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS CK40）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad680 型）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD FACSAria 型）。 微量核酸蛋白定量?jī)x（上海Boyue ScanDrop 100）、轉(zhuǎn)膜儀（北京 賽百奧17-4070）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能Tanon-1600）、水平電泳槽（上海天能HE-120）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞增殖

取P3-P5代的rBMSCs，培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，條件：37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，以1∶2 比例進(jìn)行傳代。細(xì)胞分為4 組：α-MEM 完全培養(yǎng)基（Control）組、15% FBS 成肝誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基（經(jīng)典）組、（10-6mol/L）17β-E2+α-MEM 完全培養(yǎng)基（E2）組、（10-6mol/L）17β-E2+成肝誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基（經(jīng)典+E2）組。

取P3-P5代的rBMSCs，棄去培養(yǎng)基，用D-Hanks液清洗2 次及胰酶消化制成單細(xì)胞懸液。96 孔板中每孔接種2 000 個(gè)細(xì)胞，設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，共6 行10 列，每孔加入200 μL 完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔日起，每日取1 列6 孔進(jìn)行CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)，每孔100 μL 培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8 溶液，并置于培養(yǎng)箱中孵育2.5 h 后，置于酶標(biāo)儀下，調(diào)零后測(cè)量在450 nm 處的吸光度（OD 值）。以時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制rBMSCs生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 細(xì)胞流式

制成單細(xì)胞懸液。2 000 rpm 離心6 min，去上清，用D-Hanks 液重懸細(xì)胞，重復(fù)3 次，取300 μL 單細(xì)胞懸液于1.5 mL 離心管中，再加入700 μL 無水乙醇，充分混勻，用封口膜封閉，4℃過夜。D-Hanks 液洗滌2 次，取500 μL 重懸細(xì)胞，1 600 rpm 離心10 min，棄上清，加入200 μL PI 染液，混勻，室溫避光孵育15 min，過濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3.3rBMSCs表面標(biāo)志物測(cè)定

制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為1×106cells/mL；按操作說明分別加入CD29、CD45、CD80、CD90，37℃下孵育30 min；使用流式細(xì)胞儀測(cè)定；

1.3.4rBMSCs骨向及脂向分化能力鑒定

按1.4.1 操作培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合60%左右分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用D-Hanks 液清洗3 次，分別加入95%乙醇固定10 min，用蒸餾水漂洗3 次，分別加入0.1% Tris-HCL-茜素紅染液、飽和油紅O 染液37℃孵育45 min、60 min，用蒸餾水漂洗多余Tris-HCL-茜素紅染液，60%異丙醇漂洗多油紅O 染液，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5rBMSCsAFP 的測(cè)定

按1.4.1 及1.4.2 操作培養(yǎng)細(xì)胞，第3、6、10 天對(duì)4 組細(xì)胞重懸并進(jìn)行裂解，取300 μL 置于化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測(cè)定各組AFP 值。

1.3.6 Wnt 信號(hào)通路的調(diào)控作用

按1.4.1及1.4.2操作培養(yǎng)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心后加入細(xì)胞裂解液，置于冰上；提取總蛋白，微量核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定總蛋白濃度，以1∶4 比例加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，99℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，灌膠、電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗（β-Catenin、Wnt3a、LRP-5）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2 h，顯影。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間的差異比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rBMSCs 的鑒定

鏡下見rBMSCs呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈放射狀、梭形或平行排列。且細(xì)胞形態(tài)隨傳代次數(shù)的增多而表現(xiàn)的越均一。見圖1A。rBMSCs呈倒“S”形增長(zhǎng)，從第2 d 開始快速增長(zhǎng)，第8 d 到達(dá)頂峰，隨后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，增長(zhǎng)較為緩慢。見圖1B。rBMSCsG0/G1期細(xì)胞為87.5%，G2+S/M 期細(xì)胞為12.5%，表明大部分rBMSCs處于靜息期，只有少部分細(xì)胞處于增殖期，符合干細(xì)胞生物學(xué)特性。見圖1C。

圖1 rBMSCs 的鑒定Figure1 Identification of rBMSCs

2.4 rBMSCs 表面標(biāo)志物的鑒定

結(jié)果顯示rBMSCs表達(dá)CD29、CD90 的陽性率為99.72%、97.45%；而CD45、CD80 的陽性率為1.28%、1.01%，符合干細(xì)胞生物學(xué)特性。見圖2。

圖2 P4代rBMSCs 表面標(biāo)志物的鑒定Figure2 Identification of surface markers of P4

2.5 rBMSCs 骨向及脂向分化能力鑒定

成骨誘導(dǎo)第14 天后，對(duì)rBMSCs進(jìn)行茜素紅染色，鏡下可見礦化結(jié)節(jié)中沉積的鈣鹽被染成紅褐色，而周圍細(xì)胞未著色。見圖3A。對(duì)rBMSCs進(jìn)行油紅O 染色，鏡下可見脂肪細(xì)胞因脂質(zhì)累及被染成紅色。見圖3B。

圖3 rBMSCs 的骨向及脂向分化能力鑒定（×100）Figure3 Identification of differentiation potency ofrBMSCs from P4 generation（×100）

2.7 rBMSCs 向肝祖細(xì)胞定向誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化

第3 天，經(jīng)典組與經(jīng)典+E2組的rBMSCs由長(zhǎng)梭形逐漸呈多邊形、類圓形改變，細(xì)胞增殖速度減緩，核漿比例變小，貼壁能力逐漸減弱，至第10 天，大多數(shù)細(xì)胞失去原有形態(tài)，呈三角形或肝板樣排列，與肝祖細(xì)胞形態(tài)相似。而Control 組和E2組無明顯形態(tài)學(xué)改變，基本呈均勻的長(zhǎng)梭形。見圖4。

圖4 各組rBMSCs 定向誘導(dǎo)3、6、10 d 后細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure4 Cell morphology after 3、6 and 10 days ofrBMSCs induction in each group（×100）

2.8 各組rBMSCs AFP 值的測(cè)定

Bonferroni 檢驗(yàn)結(jié)果，不同組間AFP 值均數(shù)顯著不同（F=8.948，P=0.012），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同天數(shù)間AFP 值均數(shù)無明顯改變（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)典組、經(jīng)典+E2組的AFP 值顯著增高于Control、E2組（P＜0.05），且經(jīng)典+E2組AFP 值顯著高于經(jīng)典組（P＜0.05），而Control、E2組AFP 值均為0 ng/mL。見圖5。

圖5 各組rBMSCs AFP 均值Figure5 Average AFP ofrBMSCs in each group

2.9 各組rBMSCs 肝祖細(xì)胞向分化過程中Wnt 信號(hào)通路的表達(dá)情況

運(yùn)用Western Blot 法分別檢測(cè)第3、6、10 天各組rBMSCs 中Wnt3a、β-Catenin、LRP-5 的蛋白表達(dá)量。與Control 組及E2組相比，經(jīng)典組與經(jīng)典+E2組中的β-Catenin、Wnt3a 表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），且經(jīng)典+E2組β-Catenin、Wnt3a 表達(dá)量均顯著低于經(jīng)典組（P＜0.05）；而4 組間LRP-5 的表達(dá)差異均無顯著性（P＞0.05）；且不同天數(shù)間各組β-Catenin、Wnt3a、LRP-5 的表達(dá)差異均無顯著性（P＞0.05）。見圖6。

3 討論

肝纖維化是一個(gè)不可逆的過程，若發(fā)展為肝硬化失代償期，目前治療手段有限，且病死率高。最近，肝細(xì)胞移植成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［7-8］，但如何構(gòu)建穩(wěn)定安全的功能性肝細(xì)胞體外培養(yǎng)體系仍是一個(gè)難題。BMSCs 來源于骨髓，是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其易于獲取、增殖迅速及無排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，無需考慮倫理問題，是較為理想的肝細(xì)胞源。

圖6 各組Wnt 信號(hào)蛋白的表達(dá)Figure6 Expression of Wnt signaling protein in each group

rBMSCs源于大鼠骨髓，倒置顯微鏡下觀察原代的rBMSCs多呈類圓形，貼壁生長(zhǎng)，隨著傳代次數(shù)增多，逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈簇狀生長(zhǎng)，且形態(tài)越均一。rBMSCs在骨髓有核細(xì)胞中含量不足0.1%，且其生物學(xué)特性易在體外擴(kuò)增時(shí)被破壞［9］，由此，尋找一種合適的體外培養(yǎng)體系極為重要。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)rBMSCs，通過驗(yàn)證，均符合干細(xì)胞生物學(xué)特性，從而建立了穩(wěn)定的rBMSCs體外培養(yǎng)體系。

研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，雌激素作用于BMSCs 時(shí)，除了影響其分泌生長(zhǎng)激素的量，還可降低在氧化應(yīng)激時(shí)的凋亡率，其中可能與促進(jìn)抗凋亡因子及抑制凋亡因子的表達(dá)相關(guān)。而雌激素影響B(tài)MSCs 的增殖、分化和遷移的機(jī)制主要通過核受體及質(zhì)膜受體信號(hào)通路，前者指雌激素與雌激素受體相結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而刺激BMSCs的核酸合成；后者則指通過與質(zhì)膜上表達(dá)的雌激素受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，影響B(tài)MSCs的增殖［12-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)17β-E2可促進(jìn)rBMSCs向肝祖細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與17β-E2促進(jìn)rBMSCs活化，抑制其凋亡，進(jìn)而促使更多的rBMSCs向肝祖細(xì)胞分化相關(guān)。

Wntβ-catenin 信號(hào)通路作為經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖分化、動(dòng)物胚胎形成等事件中起重要作用［14-16］。研究發(fā)現(xiàn)，Wntβ-catenin 信號(hào)通路在非肝細(xì)胞的內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肝細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)通過Wersten Blot 法檢測(cè)4 組rBMSCsWnt3a、β-Catenin、LRP-5 的蛋白表達(dá)量，結(jié)果示經(jīng)典+E2組Wnt3a、β-Catenin 蛋白含量明顯低于其它3 組，從而推測(cè)17β-E2可能通過調(diào)控Wntβ-catenin 信號(hào)通路來促進(jìn)rBMSCs向肝祖細(xì)胞分化。其機(jī)制可能與17β-E2下調(diào)Wntβcatenin 信號(hào)蛋白Wnt3a 和β-Catenin 有關(guān)。