56℃加熱滅活對流感病毒核酸檢測結(jié)果影響的初步研究

周百靈 楊光能 陳俊伶 馮星星 許彬 奎莉越 杜廷義

流行性感冒（簡稱流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是人類面臨的主要公共健康問題之一［1］。流感病毒屬于正粘病毒科，為單股、負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA 病毒，根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒的抗原變異性最大，在本世紀(jì)的四次流感大流行均是由甲型流感病毒引起的［1-2］。核酸檢測是流感病毒確診的主要方法之一［3］，在季節(jié)性流感及流感大流行中都發(fā)揮重要作用，但核酸提取過程中可能存在的暴露風(fēng)險，限制了基層實驗室開展該技術(shù)，因此簡單有效的病毒滅活前處理方法，有利于流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)大以及降低檢驗人員檢測時的感染風(fēng)險。目前新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）已成為全球大流行［4］，而流感作為新型冠狀病毒的主要鑒別疾病之一［5］，也讓流感的核酸檢測面臨著更高的感染風(fēng)險。在《流行性感冒與治療指南（2011 版）》中指出流感病毒一般可在56℃、30 min 被滅活，而此溫度也為許多指南中［6-7］建議新型冠狀病毒的滅活溫度。本研究通過對口咽拭子樣本加熱56℃、30 min病毒滅活的條件，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）進(jìn)行流感病毒的檢測，分析滅活前和滅活后甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸結(jié)果，對本實驗室疫情監(jiān)測需要做準(zhǔn)備，做了初步探討，進(jìn)行初步的數(shù)據(jù)積累，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集本院2020年1月31日至2020年2月15日收取的47例流感病毒qPCR 核酸檢測陽性的口咽拭子標(biāo)本（21例為甲型流感病毒，26例為乙型流感病毒），其中陽性標(biāo)本包括強(qiáng)陽性（n=27，Ct≤26），中等陽性（n=16，26＜Ct≤33）和弱陽性（n=4，33＜Ct≤39）；以及14例甲型流感病毒和乙型流感病毒qPCR 核酸檢測均為陰性的口咽拭子標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器

ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國Thermofisher公司）；甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

1.3 標(biāo)本處理

將-20℃凍存的口咽拭子標(biāo)本（含有1 mL 病毒運(yùn)輸液），復(fù)融后，分別吸取200 μL 于兩個無菌離心管中，一份用于常規(guī)甲型流感病毒及乙型流感病毒的核酸檢測，另一份先在56℃水浴箱中水浴30 min 后再進(jìn)行常規(guī)甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸檢測的常規(guī)操作。

1.4 核酸提取和PCR 擴(kuò)增

采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的甲型流感病毒核酸檢測試劑盒和乙型流感病毒核酸檢測試劑盒提取病毒RNA，按試劑盒操作說明進(jìn)行。在ABI7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行核酸檢測，反應(yīng)條件如下：50℃、15 min →95℃、15 min →94℃、15 s →58℃、45 s（45 個循環(huán)）。采用循環(huán)閾值（cycling threshold，CT）進(jìn)行計算。試劑盒采用一步法實時熒光PCR 技術(shù)。每批次實驗均同時檢測陰性質(zhì)控品，臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品。

1.5 檢測結(jié)果判斷

①甲型流感病毒陽性結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤39.7，乙型流感病毒陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38.0；②甲型流感病毒陰性結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM 檢測通道無擴(kuò)增曲線或FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值＞39.7，乙型流感病毒陰性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為FAM 檢測通道無擴(kuò)增曲線或FAM 檢測通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值＞38.0。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism 軟件（Version8.0）進(jìn)行處理，計量資料（）表示，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，一致性分析采用Bland-Altman 分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒陽性標(biāo)本未加熱和加熱滅活后的qPCR 結(jié)果比較

對21例甲型流感病毒核酸檢測陽性及26例乙型流感病毒核酸檢測陽性的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行未加熱和加熱后的qPCR 結(jié)果比較。兩種流感病毒在加熱后結(jié)果均為陽性，陽性結(jié)果符合率為100%。未加熱和加熱56℃、30 min 后其Ct 結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1及表2。

表1 未加熱和加熱滅活后的qPCR 結(jié)果Table1 The qPCR results of unheated and heat inactivation

表2 未加熱及加熱滅活后的qPCR 結(jié)果比較（±s）Table2 Comparison of the qPCR results between unheated and heat inactivation（±s）

表2 未加熱及加熱滅活后的qPCR 結(jié)果比較（±s）Table2 Comparison of the qPCR results between unheated and heat inactivation（±s）

n 檢測項目甲流感病毒Ct 值乙流感病毒Ct 值21 26未加熱26.98±5.07 24.83±3.77加熱后27.95±4.76 24.80±3.32t 值-1.100 0.108P 值0.284 0.915

2.2 流感病毒陽性標(biāo)本未加熱和加熱滅活后的qPCR 結(jié)果的一致性分析

流感病毒陽性標(biāo)本加熱后和未加熱的標(biāo)本結(jié)果具有良好的一致性。甲型流感病毒的qPCR 檢測分析顯示，所有點均在95%的一致性界限的置信區(qū)間以內(nèi)，且在置信區(qū)間以內(nèi)的差值在臨床上可以接受見圖1A；圖B 為乙型流感病的qPCR 檢測分析顯示，其中3.8%（1/26）的點在95%的一致性界限的置信區(qū)間以外，小于5%，且在置信區(qū)間以內(nèi)的差值在臨床上可以接受。見圖1B。

圖1 未加熱與加熱滅活病毒后結(jié)果的一致性分析Figure1 Analysis of consistent results between unheated and heat inactivation

2.3 流感病毒陰性標(biāo)本未加熱和加熱滅活后的qPCR 結(jié)果比較

對14例甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸檢測陰性的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行未加熱和加熱后的qPCR 結(jié)果比較，加熱后結(jié)果全部為陰性結(jié)果。陰性結(jié)果符合率為100%。

3 討論

加熱滅活病毒的方法不引入任何的化學(xué)試劑，僅需控制溫度和時間，能使病毒的高級結(jié)構(gòu)受到破壞，其蛋白不再有生理活性，而失去感染、致病和繁殖能力［8-9］。這種方法在牛奶消毒和血液制品病毒滅活中得到廣泛運(yùn)用，在血液制品中可用于血漿、凝血因子、抗凝血劑、蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白等產(chǎn)品的制備［10］。而在臨床檢驗方面，為減少實驗室人員感染傳染性及致病性較強(qiáng)的病毒（如埃博拉病毒、馬爾堡病毒及沙拉病毒等）風(fēng)險，更多研究關(guān)注于將血漿或血清標(biāo)本加熱滅活后的對生化結(jié)果的影響［11-12］，但對加熱滅活后對核酸檢測的影響研究較少。鄢心革［13］等人利用不同溫度對SARS 冠狀病毒抗原性滅活效果的研究中發(fā)現(xiàn)，56℃、60 min 比56℃、30 min 對SARS 冠狀病毒滅活的效果好，同時此溫度滅活30 min 及60 min 核酸的含量變化不大；陳培松［14］等的研究發(fā)現(xiàn)56℃、30 min 和75%乙醇處理和未滅活處理的標(biāo)本結(jié)果具有明顯的相關(guān)性且一致性良好；張沁欣［15］等的研究發(fā)現(xiàn)在沒有核糖核酸酶抑制劑的保護(hù)下，56℃滅活導(dǎo)致豬流行性腹瀉病毒冠狀病毒RNA 的明顯降解，而添加RNA 酶抑制劑后則RNA 降解得到一定程度的改善。

本研究采用56℃、30 min 進(jìn)行病毒滅活，此溫度下在滅活新型冠狀病毒的同時，流感病毒也被滅活，這對實驗室核酸檢測人員是極大地保護(hù)。但從一致性分析及差異結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒陽性標(biāo)本中有三例標(biāo)本在加熱后其Ct 值反而遠(yuǎn)低于未加熱的Ct 值，而在乙型流感病毒陽性標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)在加熱后其Ct 值反而低于未加熱的Ct值此現(xiàn)象，考慮原因主要為以下三點：①可能為此溫度加熱滅活下可以促進(jìn)RNA 和蛋白復(fù)合物的分離，因而使得加熱滅活后核酸提取效率更高；②本試劑盒檢測的甲型流感病毒的亞型不僅僅只為一種，而實際收集的樣本中可能含有甲型流感病毒的不同亞型，而不同亞型之間可能對熱滅活的效果不一樣；③可能手工提取核酸及核酸擴(kuò)增帶來的誤差。在甲型流感病毒的實驗中，其未加熱的qPCR 結(jié)果與加熱后的差異大于乙型流感病毒的差異，是否與加熱滅活病毒后對甲型流感病毒的檢測效率影響更大尚不明確。

加熱滅活病毒的方法操作簡單、經(jīng)濟(jì)同時不引入其他化學(xué)試劑，對樣本進(jìn)行加熱滅活病毒的前處理可以降低病毒核酸檢測實驗室人員的感染風(fēng)險。對于熱滅活病毒后是否影響核酸檢測效率存在不同意見［16］，而這方面的研究資料也較少，因此加熱滅活或其它滅活手段對病毒核酸檢測結(jié)果的影響評估尤為迫切和重要，因為該項評估的完成有利于加強(qiáng)實驗室對高風(fēng)險樣本的處置管理，同時有利于更好地滿足特殊情況下臨床診斷和鑒別診斷的客觀需要。實驗室有必要收集整理相關(guān)資料，并全面完成滅活手段對臨床相關(guān)檢測項目的影響評估。

本實驗室對加熱滅活病毒的初步研究中發(fā)現(xiàn)，對咽拭子標(biāo)本采用加熱56℃、30 min 滅活病毒后再進(jìn)行甲型流感病毒以及乙型流感病毒的qPCR 檢測，其結(jié)果沒有明顯影響；但在本研究中也存在許多不足之處：①由于實驗室條件限制，不能進(jìn)行滅活后病毒培養(yǎng)，從而無法評估此條件下病毒滅活的效率，因此其降低實驗室檢測的生物安全壓力的程度尚不能完全評估；②對于流感病毒的陽性標(biāo)本上，弱陽性標(biāo)本占比較少（僅有4例甲型流感病毒弱陽性標(biāo)本），尚不能有效評估加熱滅活對流感病毒核酸檢測臨界陽性樣本的影響。③本次初步研究完全模擬日常檢測流程，檢測過程中的隨機(jī)誤差因素未得到更為有效的控制。上述不足將在隨后展開的評估中得到進(jìn)一步改進(jìn)和完善。