快速檢測洋蔥伯克霍爾德菌巢式熒光定量PCR法建立

林麗英 鄧穗燕 郭旭光

洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合體（Burkholderia cepaciacomplex，Bcc）由一組廣泛分布于自然界和人工環(huán)境中的相關(guān)細(xì)菌組成，是革蘭氏陰性、運動性和需氧菌，具有非發(fā)酵特性［1-2］。它們生活在自然界，特別是土壤、水和植物產(chǎn)品中，是多種抗藥性的有機體，能抵抗許多消毒劑、清潔劑和防腐劑的影響［1］。Bcc還具有形成生物膜和污染塑料、金屬、水系統(tǒng)以及制藥設(shè)施的巨大能力［1］。近年來在臨床檢測中逐漸發(fā)現(xiàn)，洋蔥伯克霍爾德菌是一種機會性病原體，主要在免疫低下人群中引起疾病。由其引起的最嚴(yán)重的疾病包括肺炎或細(xì)菌感染，這些疾病發(fā)生在免疫系統(tǒng)受損或慢性肺病患者身上，特別是囊性纖維化［3-5］。因此，如何方便檢測出洋蔥伯克霍爾德菌感染，將有利于臨床用藥治療。盡管，對洋蔥伯克霍爾德菌的分類研究已經(jīng)改進了其鑒定，但將洋蔥伯克霍爾德菌與其他相關(guān)分類群，如羅氏菌、銅毒菌、無色桿菌和短枝單胞菌等的區(qū)分仍然很困難［6］。在用于鑒定洋蔥伯克霍爾德菌的分子方法中，基于recA基因的分析目前具有較高的分辨能力，能夠比較有效區(qū)分Bcc 群內(nèi)菌種［7］。因此，本研究根據(jù)已有檢測方法進行改良，期望建立一種能直接快速進行臨床檢測洋蔥伯克霍爾德菌感染的有效方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與標(biāo)本

洋蔥伯克霍爾德菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25416）、銅綠假單胞菌（ATCC 9027）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、大腸桿菌（ATCC 8739）、沃氏葡萄球菌、藤黃微球菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、皮氏羅爾斯頓菌和阿邦尼沙門氏菌購自中國菌種保藏中心。35例痰標(biāo)本來源于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院的囊性纖維化患者，所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)進行。檢測標(biāo)本例數(shù)的確定根據(jù)診斷試驗樣本量計算公式進行計算，其中Z1-α/2=1.96，P=0.9 為敏感度，δ=0.1 為把握度，則達到統(tǒng)計差異所需樣本量約為35。

1.2 基因組DNA 提取

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進行，先離心收集菌體，加入重懸液徹底懸浮。加入蛋白酶K 和裂解液，漩渦振蕩混勻形成均一的懸浮液，65℃溫浴10 min。加入無水乙醇上下顛倒混勻，然后轉(zhuǎn)移到純化柱中，12 000 rpm 離心1 min，棄濾液。加入去蛋白液和漂洗液洗滌，空甩以徹底去除純化柱中殘留的液體。向純化柱中央處懸空加入50 μL洗脫液，室溫放置2 min 后于13 000 rpm 離心2 min，管底即為高純度基因組DNA。繼續(xù)用分光光度計測得DNA 濃度，剩余樣品可放置-20℃保存。

1.3 巢式熒光定量PCR

以提取基因組DNA 為模板，用外引物BCR1-F（5′-ATGACCGCCGAGAAGAGCAA-3′）和BCR1-R（5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）進行第一輪PCR 擴增，反應(yīng)條件如下：96℃5 min，（96℃30 sec、58℃30 sec、72℃1 min）25 個循環(huán)，72℃10 min。以第一輪的PCR 產(chǎn)物1 μL 作為模板，以內(nèi)引物recA-MF（5′-ATGACCGCCGAGAAGAG-3′）和recA-MR（5′-TGGAGACGACCTGGATAT-3′）進行染料法熒光定量PCR，反應(yīng)條件如下：95℃5 min，（95℃15 sec、60℃32 sec）40 個循環(huán)。

1.4 菌種的生化鑒定

采用Vitek-2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司生產(chǎn)）和配套的革蘭氏陰性菌（Gram-negative，GN）鑒定卡進行臨床標(biāo)本的菌種生化鑒定，按儀器的操作手冊進行。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用χ2檢驗比較分析兩種檢測方法的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巢式定量PCR 的特異性

為了提高檢測的特異性，本研究首先針對recA基因設(shè)計外引物進行首輪擴增，然后以此產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)引物進行熒光定量PCR。結(jié)果表明，只有洋蔥伯克霍爾德菌的標(biāo)準(zhǔn)株（B.cepaciaATCC 25416）有擴增曲線，而其他參考菌株均沒有明顯的擴增曲線（圖1）。這說明，本方法可以特異檢測洋蔥伯克霍爾德菌，而對其他菌株呈陰性反應(yīng)。

圖1 不同菌株進行巢式定量PCR 的擴增曲線Figure1 Amplification curves of nested quantitative PCR for different bacterial strains

2.2 巢式定量PCR 的靈敏度

對洋蔥伯克霍爾德菌進行計數(shù)，計算出菌液濃度后進行梯度稀釋：1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL。對上述梯度菌液進行巢式定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，除了濃度1×100CFU/mL 外，上述其他濃度的菌液均有良好的擴增曲線，低至1×101CFU/mL 的菌液仍能被檢測出（圖2）。進一步提取洋蔥伯克霍爾德菌的基因組DNA 進行定量，按所得濃度進行梯度稀釋：1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6ng/μL。各取1 μL 進行檢測發(fā)現(xiàn)，除了1×10-6ng/μL 的菌液外，低至1×10-5ng/μL 的菌液仍然有良好的擴增曲線（圖3）。

圖2 不同濃度洋蔥伯克霍爾德菌進行巢式定量PCR 的擴增曲線Figure2 Amplification curves of Burkholderia cepacia with different concentrations by nested quantitative PCR

圖3 洋蔥伯克霍爾德菌不同濃度基因組DNA 進行巢式定量PCR 的擴增曲線Figure3 Amplification curves of Burkholderia cepacia genomic DNA in different concentrations by nested quantitative PCR

2.3 巢式定量PCR 對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果

收集35例囊性纖維化患者痰標(biāo)本分別用巢式定量PCR 和Vitek 2 Compact 儀器進行鑒定。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vitek 2 Compact 儀器鑒定出10例標(biāo)本有洋蔥伯克霍爾德菌感染，有4例標(biāo)本未檢出，其余為其他細(xì)菌感染。而用巢式定量PCR 檢測表明，與Vitek 2 Compact 儀器鑒定結(jié)果相比，其他細(xì)菌感染的標(biāo)本無信號，但檢測出洋蔥伯克霍爾德菌感染的標(biāo)本共14例，含Vitek 2 Compact 儀器無法檢測的4例標(biāo)本。巢式定量PCR 比Vitek 2 Compact 儀器對洋蔥伯克霍爾德菌感染的檢出率更高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.560，P=0.454）。

3 討論

近年來的臨床檢測發(fā)現(xiàn)，洋蔥伯克霍爾德菌已成為人類感染的主要致病菌，已在多種疾病中被檢測到，能加重疾病的進展［1］。因而，建立一種快速有效的臨床檢測方法能有利于疾病的及時治療，減輕疾病向重癥發(fā)展。

對于細(xì)菌的鑒定，目前已有成熟的方法，就是針對16S rRNA 進行特異擴增或序列測定，是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)［8］。但16S rRNA 的序列在Bcc 菌種間的同源性高達98%～100%，從而無法將Bcc 鑒別到種［8］。近年來對洋蔥伯克霍爾德菌的序列分析表明，其recA基因序列能有效區(qū)分Bcc 群內(nèi)菌種［8-10］。因此，目前針對recA基因而展開的檢測方法已有一定的進展。例如，周江林等［8］根據(jù)recA基因全長序列而進行的菌株全基因組平均核酸一致性值比較能有效糾正Bcc 復(fù)合群細(xì)菌的種鑒定信息。比較recA標(biāo)準(zhǔn)序列比對法和多位點序列分型技術(shù)對Bcc 種別鑒定的效果發(fā)現(xiàn)，兩種方法的一致性為98.9%，但recA標(biāo)準(zhǔn)序列比對法具有更高的靈敏度（98.9%），且特異度達到100%，因而認(rèn)為recA標(biāo)準(zhǔn)序列比對法更適合于醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查和臨床篩檢［11］。余萌等［12］也認(rèn)為，recA序列同源性分析可將藥品中污染的Bcc 菌有效鑒別到種水平。本研究根據(jù)recA基因序列設(shè)計引物進行檢測發(fā)現(xiàn)，本方法具有良好的特異性，只針對洋蔥伯克霍爾德菌有擴增信號，而對其他菌屬無擴增信號。因此，根據(jù)recA基因進行洋蔥伯克霍爾德菌鑒定檢測具有理論可行性和實際應(yīng)用意義。

目前對于洋蔥伯克霍爾德菌的鑒定檢測已發(fā)展出多種方法，且不斷在改進中。例如，根據(jù)伯克霍爾德菌屬的gyrB基因設(shè)計引物，擴增測序后進行聚類比對分析發(fā)現(xiàn)，此方法可滿足“種”水平的鑒定［13］。針對另一個特異基因hisA的研究也指出，所擴增的442 bp 的hisA-DNA 片段進行測序后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明hisA區(qū)可以區(qū)分所有Bcc 物種，說明該基因片段可用于Bcc 菌株的鑒定［14］。孫謙等［15］利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）的方法可將洋蔥伯克霍爾德菌群快速準(zhǔn)確的鑒定至基因型。但Furlan 等［16］比較了不同的鑒定方法發(fā)現(xiàn)，表型鑒定不適用于Bcc 病原體的鑒定，VITEK 2 和MALDI-TOF MS 只能鑒定到不同的細(xì)菌屬，16S rRNA 測序和recA基因PCR 擴增能鑒定到Bcc 菌群，且recA基因PCR 擴增具有更高的特異性。Lambiase 等［17］也認(rèn)為，MALDI-TOF MS 對于Bcc 的鑒定具有一定的局限性。Zakharova 等［18］建立了一種基于檢測單個β-內(nèi)酰胺酶基因集的多重PCR 方法，能用于類鼻疽伯克霍爾德菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、泰國伯克霍爾德菌和Bcc 的一步鑒定和分類；兩對針對一類獨特的金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的特異性引物和一對針對苯唑西林水解D 類β-內(nèi)酰胺酶基因特異性引物可成功區(qū)分Bcc 內(nèi)的物種。上述有些方法準(zhǔn)確度較高，但仍存在一定的缺點，不夠快速、直接和靈敏。

鑒于熒光定量PCR 的特異、靈敏和快速方便等特點，其已越來越多的應(yīng)用于臨床檢測中。例如，傅瓊瑤等［19］根據(jù)類鼻疽伯克霍爾德菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)保守基因的序列設(shè)計特異引物和探針，采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，此方法靈敏度可達到10 copies/μL，可檢測出土壤標(biāo)本中低濃度的類鼻疽伯克霍爾德菌。Jimenez 等［20］利用實時熒光定量PCR 檢測16S rRNA 的表達可有效檢測出藥品中污染的低濃度洋蔥伯克霍爾德菌，其最低檢測濃度為10 fg/μL，相關(guān)系數(shù)為0.98。Wright 等［21］針對recA基因進行的實時定量PCR 也能有效檢測出患者中的洋蔥伯克霍爾德菌感染。本研究在上述的基礎(chǔ)上，采用巢式熒光定量PCR的方法，進一步提高了洋蔥伯克霍爾德菌感染的檢出率，具有更好的檢測應(yīng)用價值。

本研究表明，巢式熒光定量PCR 是一種可靠的方法，可直接用于臨床洋蔥伯克霍爾德菌感染的快速檢測，從而為疾病的及時和準(zhǔn)確治療提供極大的便利性。