膿毒癥患者循環(huán)miR-21、miR-155變化與炎癥細(xì)胞因子和心功能障礙的相關(guān)性

賈啟明 張濤 賀娜娜 魏蕾

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒癥休克并引起多器官功能障礙的發(fā)生，病死率高、救治難度大。心臟是膿毒癥病程中常見(jiàn)的受累靶器官，膿毒癥患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活、炎癥細(xì)胞因子的大量釋放會(huì)引起心肌細(xì)胞損害、造成心臟舒縮功能減退，在此基礎(chǔ)上可出現(xiàn)循環(huán)障礙并加速休克及多器官功能障礙的發(fā)生［1-2］。近年來(lái)，多種微小RNA（microRNA，miR）被證實(shí)參與膿毒癥、心肌損傷、炎癥反應(yīng)的過(guò)程，其中miR-21 及miR-155 兩種miRs 在膿毒癥患者的循環(huán)中呈顯著高表達(dá)［3-4］。miR-21 和miR-155可能靶向調(diào)節(jié)多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及分泌，但膿毒癥合并心功能障礙患者循環(huán)miR-21 及miR-155 的變化、與炎癥因子分泌的關(guān)系及臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將觀察膿毒癥患者循環(huán)miR-21，miR-155 變化與心功能障礙、炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性，分析miR-21，miR-155 變化與膿毒癥合并心功能障礙患者循病情及預(yù)后的相關(guān)性，以期為臨床評(píng)價(jià)膿毒癥合并心功能障礙患者的病情及預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年3月至2018年12月期間在本院診斷為膿毒癥的58例患者作為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②臨床資料與預(yù)后資料完整；③入院后24 小時(shí)內(nèi)接受心臟多普勒超聲檢查；④入院后24 小時(shí)內(nèi)留取靜脈血及血清標(biāo)本。⑤所有患者及家屬均已簽署知情同意書(shū)；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并或既往有病毒性心肌炎、心肌梗死；②合并惡性腫瘤、結(jié)締組織??；③膿毒癥前已經(jīng)出現(xiàn)心功能障礙。根據(jù)入院后24 小時(shí)內(nèi)心臟多普勒超聲結(jié)果分為L(zhǎng)VEF＜50%組及LVEF≥50%組。另取同期在本院體檢的健康志愿者40例作為對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)本院倫理委員同意批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 心功能的測(cè)定

膿毒癥患者入院后24 小時(shí)內(nèi)接受床旁心臟多普勒超聲檢查，對(duì)照組志愿者體檢時(shí)進(jìn)行心臟多普勒超聲檢查，探頭頻率1-5MHz，獲取胸骨旁左心室長(zhǎng)軸圖像后測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)的檢測(cè)

膿毒癥患者入院后24 h 內(nèi)采集肘靜脈血3 mL，對(duì)照組志愿者體檢時(shí)采集肘靜脈血3 mL，采用血液RNA 提取試劑盒（北京百奧萊博公司、批號(hào)：BTN3071-IQS）提取RNA，采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根公司、批號(hào)KR211）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用miRNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（北京天根公司、批號(hào)FP401）對(duì)miR-21、miR-155、U6進(jìn)行擴(kuò)增，miR-21 的上游引物為5′-GATCCTAGCATCGTAGCTA-3′、下游引物為試劑盒通用引物，miR-155 的上游引物為5′-TAGCTAGCTAGCTAGCTA-3′、下游引物為試劑盒通用引物；U6 的下游引物為5′-TAGATCGTATAGCTAT-3′、下游引物為5′-TAAGCTAGCTAGCTAGCTA-5′。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3 min 后95℃15 s、60℃30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-21、miR-155的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 血清生化指標(biāo)及細(xì)胞因子的檢測(cè)

膿毒癥患者入院后24 h 內(nèi)采集肘靜脈血3 mL，對(duì)照組志愿者體檢時(shí)采集肘靜脈血3 mL，離心分離血清后采用全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)AU5800）測(cè)定C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（Procalcitonin，PCT）、肌鈣蛋白I（Cardiac tropnin I，cTnI）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的含量，采用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor - α，TNF - α）（批號(hào)：ml077385）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）（批號(hào)：ml028590）、細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）（批號(hào)：ml060413）的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)，多因素分析采用logistics 回歸分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組一般資料的比較

3 組間性別、年齡、BMI 的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；血清CRP、PCT、cTnI、BNP 含量比較結(jié)果：LVEF＜50%組＜LVEF≥50%組＜對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 組一般資料的比較（±s）Table1 ccomparison of general data among 3 groups（±s）

表1 3 組一般資料的比較（±s）Table1 ccomparison of general data among 3 groups（±s）

資料性別（男/女）年齡（歲）BMI（kg/m2）CRP（mg/L）PCT（ng/mL）cTnI（ng/mL）BNP（ng/L）對(duì)照組（n=40）23/17 42.39±9.59 22.93±5.82 3.28±0.62 0.58±0.08 0.45±0.08 32.93±7.95 LVEF≥50%組（n=38）22/16 45.12±10.92 23.14±6.14 30.38±7.82 3.29±0.68 0.68±0.12 63.29±10.29 LVEF＜50%組（n=20）12/8 40.39±11.87 22.46±5.67 61.39±9.94 14.69±3.94 1.52±0.20 132.29±21.29Z/F 值0.036 1.432 0.087 530.616 417.803 481.609 417.546P 值0.982 0.244 0.917 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 3 組循環(huán)miR-21，miR-155 及血清炎癥因子的比較

3組循環(huán)miR-21，miR-155表達(dá)量及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量比較結(jié)果顯示：LVEF＜50%組最高，其次是LVEF≥50%組，對(duì)照組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3 組循環(huán)miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比較（±s）Table2 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 among 3 groups（±s）

表2 3 組循環(huán)miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比較（±s）Table2 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 among 3 groups（±s）

組別對(duì)照組LVEF≥50%組LVEF＜50%組F 值P 值n 40 38 20 miR-21 1.02±0.19 1.42±0.23 2.19±0.42 129.091 0.000 miR-155 0.97±0.16 1.38±0.19 1.83±0.32 113.378 0.000 TNF-α（ng/L）9.38±1.32 20.19±4.82 57.92±9.94 543.380 0.000 IL-2（ng/L）14.28±2.37 32.93±6.48 82.93±13.28 586.608 0.000 ICAM-1（ng/mL）126.49±17.96 349.58±62.39 649.39±85.93 592.120 0.000

2.3 LVEF＜50%組miR-21，miR-155 與血清指標(biāo)的相關(guān)性

LVEF＜50%組患者的循環(huán)miR-21，miR-155表達(dá)量與血清CRP、PCT、cTnI、BNP、TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見(jiàn)表3。

表3 LVEF ＜50%組miR-21，miR-155 與血清指標(biāo)的相關(guān)性Table3 correlation between miR-21，miR-155 and serum index in LVEF ＜50%group

2.4 LVEF＜50% 組中存活及死亡患者循環(huán)miR-21，miR-155 及血清炎癥因子的比較

LVEF＜50%組中死亡患者的循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)量及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均明顯高于存活患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見(jiàn)表4。

2.5 LVEF＜50%組患者治療結(jié)局的相關(guān)因素

以LVEF＜50%組患者是否死亡作為治療結(jié)局的應(yīng)變量，以循環(huán)miR-21，miR-155 及血清CRP、PCT、cTnI、BNP、TNF-α、IL-2、ICAM-1 作為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistics 回歸分析，miR-21，miR-155 表達(dá)量與血清PCT、TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量增多是LVEF＜50%的膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素，血清CRP、BNP 與LVEF＜50%的膿毒癥患者死亡無(wú)明顯關(guān)系見(jiàn)表5。

3 討論

膿毒癥累及心臟時(shí)可引起心功能障礙并增加患者死亡率。膿毒癥患者發(fā)生心功能障礙的主要病理生理機(jī)制是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活［6-7］。相關(guān)研究表明，miR-21 和miR-155 分別靶向JAK2/STAT3 通路、TLR4 通路來(lái)發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用［8-10］；在膿毒癥患者的循環(huán)血中，miR-21及miR-155 的表達(dá)均明顯增多［3-4］。在此基礎(chǔ)上，本研究分析了miR-21 及miR-155 在膿毒癥合并心功能障礙中的應(yīng)用價(jià)值并發(fā)現(xiàn)miR-21 及miR-155表達(dá)增多與膿毒癥患者心功能障礙的發(fā)生有關(guān)，與與已有的膿毒癥相關(guān)研究一致，出現(xiàn)這一變化的原因可能與機(jī)體的代償機(jī)制有關(guān)，在膿毒癥患者炎癥反應(yīng)過(guò)度激活的過(guò)程中、miR-21 及miR-155表達(dá)代償性增多以起到保護(hù)作用。

表4 LVEF ＜50%組中存活及死亡患者循環(huán)miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比較［n，（±s）］Table4 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 between survival and death patients in LVEF ＜50%group［n，（±s）］

表4 LVEF ＜50%組中存活及死亡患者循環(huán)miR-21，miR-155 及血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 的比較［n，（±s）］Table4 comparison of circulation miR-21，miR-155 and serum TNF-α，IL-2，ICAM-1 between survival and death patients in LVEF ＜50%group［n，（±s）］

LVEF＜50%組存活患者死亡患者t 值P 值n 12 8 miR-21 1.57±0.27 2.75±0.54 6.505 0.000 miR-155 1.48±0.23 2.18±0.41 4.906 0.000 TNF-α（ng/L）41.23±7.42 74.61±13.28 7.233 0.000 IL-2（ng/L）62.58±10.38 106.61±18.59 6.817 0.000 ICAM-1（ng/mL）501.23±68.69 795.51±101.29 7.777 0.000

表5 LVEF ＜50%組患者治療結(jié)局的相關(guān)因素分析Table5 related factors analysis of treatment outcome of patients in LVEF ＜50%group

炎癥反應(yīng)激活是造成膿毒癥患者發(fā)生心功能障礙的重要因素，CRP 及PCT 是用于評(píng)價(jià)膿毒癥病情的指標(biāo)［11-12］，cTnI 及BNP 是用于評(píng)價(jià)心肌損害及心功能減退的指標(biāo)［13-14］。本研究的分析證實(shí)，在膿毒癥患者心功能惡化的過(guò)程中，CRP、PCT、cTnI、BNP 含量均明顯高于且LVEF＜50%組患者miR-21，miR-155 表達(dá)量與血清CRP、PCT、cTnI、BNP 呈正相關(guān)，說(shuō)明循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)量的增多與膿毒癥合并心功能障礙病情發(fā)展變化相關(guān)，結(jié)合miR-21 及miR-155 所介導(dǎo)的抑炎作用推測(cè)，膿毒癥合并心功能障礙病情發(fā)展變化過(guò)程中miR-21及miR-155 的增多不足以代償機(jī)體炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活，心肌損傷仍然發(fā)生了損傷。

miR-21，miR-155 的主要生物學(xué)作用是抑制炎癥反應(yīng)，膿毒癥合并心功能障礙患者循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)量的增多可能是機(jī)體自我保護(hù)的代償機(jī)制。TNF-α、IL-2、ICAM-1是在膿毒癥過(guò)程中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子［15-17］。本研究對(duì)炎癥因子的分析證實(shí)，在膿毒癥患者心功能惡化的過(guò)程中，血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 含量均明顯升高且LVEF＜50%組miR-21，miR-155 表達(dá)量與血清TNF-α、IL-2、ICAM-1 呈正相關(guān)，這一相關(guān)性與miR-21 及miR-155 介導(dǎo)的抑炎作用不一致，其可能的原因是膿毒癥患者體內(nèi)miR-21，miR-155 的增多不足以代償炎癥反應(yīng)的放大激活，導(dǎo)致炎癥的感染因素仍持續(xù)存在，因此出現(xiàn)了多種炎癥細(xì)胞因子的大量釋放。

最后，本研究還對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后進(jìn)行了隨訪，通過(guò)比較死亡患者與存活患者miR-21，miR-155 的差異可知，循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)量的增多與治療結(jié)局有關(guān)，死亡患者的循環(huán)miR-21，miR-155 表達(dá)量均明顯高于存活患者。進(jìn)一步通過(guò)logistics 回歸分析驗(yàn)證miR-21，miR-155 表達(dá)量與膿毒癥合并心功能障礙患者治療結(jié)局的關(guān)系可知：miR-21，miR-155 表達(dá)量增多是膿毒癥合并心功能障礙患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明miR-21，miR-155 表達(dá)量對(duì)膿毒癥合并心功能障礙患者的預(yù)后具有評(píng)估價(jià)值。

綜上所述，膿毒癥患者循環(huán)miR-21，miR-155明顯增多與心功能障礙有關(guān)、同時(shí)也是影響膿毒癥合并心功能障礙患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，未來(lái)miR-21，miR-155 不僅能夠作為評(píng)價(jià)膿毒癥合并心功能障礙患者病情及預(yù)后的標(biāo)志物。