葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變永生化淋巴細(xì)胞系的建立

賈崢 張艷艷 孫楠 張文新 高飛 孫晶 黃杰★ 曲守方★

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是由位于X 染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)8 帶（Xq28）的G6PD基因突變導(dǎo)致G6PD 酶合成缺陷引起，是一種以溶血性貧血為主要臨床特征的遺傳病，常見臨床表現(xiàn)有新生兒黃疸、新生兒高膽紅素血癥、蠶豆病、藥物性溶血、某些感染性溶血等［1-2］。本病在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，尤以廣東、海南、廣西、云南、貴州、四川等地為高發(fā)區(qū)。G6PD 缺乏癥患者多數(shù)平時(shí)無(wú)臨床癥狀，早期診斷和干預(yù)非常重要。在G6PD 缺乏癥的高發(fā)地區(qū)，應(yīng)開展G6PD 缺乏癥篩查。作為一種X-連鎖不完全顯性遺傳病，男性攜帶突變（男性半合子）表現(xiàn)為明顯的酶活性缺乏，女性攜帶純合突變或雜合突變時(shí)（稱為女性雜合子），發(fā)病情況因人而異。部分女性雜合子的酶活性可能接近正常不表現(xiàn)缺乏，因此不易通過酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，可以通過細(xì)胞化學(xué)染色體法和基因檢測(cè)等方法明確突變狀態(tài)［3］。G6PD 缺乏癥的分子檢測(cè)方法，包括熒光探針PCR熔解曲線法、基因芯片、反向點(diǎn)雜交、測(cè)序和飛行時(shí)間質(zhì)譜等，提高了女性雜合子的檢出率［4-7］。

目前尚無(wú)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的國(guó)家參考品，亟需建立相應(yīng)的國(guó)家參考品，用于評(píng)價(jià)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變?cè)噭┖械馁|(zhì)量。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥作為一種單基因病，該類參考品的制瓶頸是難以保證持續(xù)獲得臨床樣本，解決的思路是建立永生化淋巴細(xì)胞系或者構(gòu)建基因編輯細(xì)胞系。本院通過建立葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的永生化淋巴細(xì)胞系，可以提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的遺傳資源，并采用二代測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源及處理

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，聯(lián)系珠海市婦幼保健院，招募自愿參與項(xiàng)目的樣品捐獻(xiàn)者33 人，簽署知情同意書。每人抽取10 mL 外周血，血液樣本采集到枸櫞酸鹽或檸檬酸鹽抗凝的真空采集管。采集外周血后進(jìn)行永生化淋巴細(xì)胞系建系。

1.1.2 試劑和儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和青霉素鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液、環(huán)孢霉素A 和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）由廈門致善生物科技有限公司提供；基因組DNA提取試劑盒（磁珠法）由深圳華大智造科技有限公司提供；新生兒基因檢測(cè)試劑盒由華大基因股份有限公司提供。

上海宏石SLAN-96S 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)，廈門致善生物科技有限公司提供；MGISEQ-2000 基因測(cè)序儀，深圳華大智造科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 樣本的篩查

使用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法），按照說(shuō)明書的操作方法，對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 永生化淋巴細(xì)胞系的建立

1.2.2.1 EBV 病毒液的制備 復(fù)蘇B95-8 細(xì)胞株，采用RPMI 1640 培養(yǎng)基加胎牛血清（FBS）進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 天補(bǔ)液一次，逐漸增加培養(yǎng)基的用量。饑餓培養(yǎng)10 天后，收集細(xì)胞在液氮及37℃條件下反復(fù)凍融3 次，2 000 rpm 離心10 min。收集上清液，使用0.2 μm 濾膜的細(xì)胞濾器進(jìn)行過濾后，備用。

1.2.2.2 單核B 淋巴細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)化 取采集的外周血5 mL，加入等體積的含有青霉素鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋血液。將稀釋后的血液緩緩加入已分裝在離心管內(nèi)的淋巴細(xì)胞分層液中，2 000 rpm 離心20 min。小心吸取白膜層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入含有雙抗的RPM1640 培養(yǎng)基8 mL 洗滌2 次，1 500 rpm 離心10 min 后，去上清。然后加入分裝好的EBV 病毒液1.5 mL、環(huán)孢霉素A 0.4 mL 以及完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞懸液接種至T25 培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2.3 永生化淋巴細(xì)胞系凍存 接種培養(yǎng)24～48 h 后，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況并拍照。觀察細(xì)胞狀態(tài)及聚團(tuán)大小，適當(dāng)加入少量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。一周后觀察細(xì)胞聚團(tuán)數(shù)量及細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)行半換液。待培養(yǎng)液顏色變淺黃，細(xì)胞聚團(tuán)多且密集時(shí)，1 300 rpm 離心5 分鐘，傳代。待細(xì)胞培養(yǎng)至足夠數(shù)量時(shí)（3～6×106個(gè)/mL），1 300 rpm 離心5 分鐘，收集細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量加入含10%DMSO 凍存液，調(diào)整細(xì)胞凍存濃度，按所需要求將細(xì)胞分裝至凍存管。然后按照標(biāo)準(zhǔn)凍存操作程序進(jìn)行梯度降溫存儲(chǔ)，最終轉(zhuǎn)移至液氮進(jìn)行長(zhǎng)期存儲(chǔ)。

1.2.3 永生化淋巴細(xì)胞系的驗(yàn)證

將永生化淋巴細(xì)胞系取出復(fù)蘇后進(jìn)行基因組DNA 提取，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性。采用新生兒基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。采用酶切的方法將基因組DNA 打斷為100～200 bp 左右的DNA 片段，通過末端修復(fù)，加A 和接頭連接后，進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物采用DNA 探針進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域富集后，使用MGISEQ-2000 基因測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 樣本篩查

采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法），根據(jù)與探針雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的差異來(lái)檢測(cè)G6PD基因突變。通過比較檢測(cè)樣本在反應(yīng)液A 和反應(yīng)液B 體系中FAM、HEX、ROX 和CY5 共8 個(gè)檢測(cè)通道的熔解峰與野生型對(duì)照對(duì)應(yīng)通道的熔解峰之間熔點(diǎn)（Tm 值）的差異判斷樣本是否發(fā)生突變。當(dāng)樣本熔解峰與野生型對(duì)照對(duì)應(yīng)熔解峰差異（ΔTm 值）在±1℃以內(nèi)的即為野生型峰，差異超過±2℃的即為突變型峰，最后篩查出不同突變類型的樣本。33例樣本的篩查結(jié)果可見表1。CNGB030108 樣本在反應(yīng)液A 體系CY5 檢測(cè)通道出現(xiàn)野生峰和突變峰的融合峰，而其它7 個(gè)通道的熔解峰均為野生峰，且突變峰與野生型對(duì)照的熔解峰差異在（-4.8℃）～（-3℃）范圍內(nèi)，表明是1376（G＞T）雜合型突變；在反應(yīng)液B 體系ROX 檢測(cè)通道出現(xiàn)野生峰和突變峰的融合峰，而其它7 個(gè)通道的熔解峰均為野生峰，且突變峰與野生型對(duì)照的熔解峰差異在5.19℃～6.41℃范圍內(nèi)，表明是519（C＞T）雜合型，見圖1。

2.2 永生化淋巴細(xì)胞系的建立

采用EBV 轉(zhuǎn)化加環(huán)孢霉素A 法，共完成33例樣本建系，其中27例樣本建系成功，6例因細(xì)菌污染導(dǎo)致失敗，建系成功率為81%，復(fù)蘇成功率為100%，可以傳代用于實(shí)驗(yàn)研究。在倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)化后96 h 內(nèi)，細(xì)胞體積明顯增大，聚團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)增多；轉(zhuǎn)化2 周后，肉眼可見細(xì)胞聚團(tuán)物，顯微鏡下觀察大量細(xì)胞聚團(tuán)；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)3～4 周后，顯微鏡下觀察細(xì)胞外壁呈不規(guī)則毛刺狀突起，增殖旺盛，表明建系成功，見圖2A～圖2C。

表1 樣本的篩查結(jié)果Table1 The screening results of samples

圖1 CNGB030108 樣本篩查結(jié)果Figure1 The screening result of CNGB030108

2.3 永生化淋巴細(xì)胞系的驗(yàn)證

用基因組DNA 提取試劑盒提取的永生化淋巴細(xì)胞系樣本基因組DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示DNA 條帶完整，沒有拖帶或彌散帶，表明基因組DNA 具有很好的完整性。

圖2 永生化淋巴細(xì)胞系轉(zhuǎn)化第0、15 天和30 天結(jié)果（×50）Figure2 The result of immortalized lymphocyte cell line transformation on day 0，day15 and day 30（×50）

采用高通量測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，樣本的結(jié)果均與采用熒光PCR 熔解曲線法篩查的結(jié)果一致，見圖3和表2。CNGB030108 樣本的測(cè)序結(jié)果顯示在X 染色體153 762 678 bp（人類基因組hg19）位置處檢測(cè)到94 條reads 支持C 堿基（正向是G 堿基）和108 條reads 支持T 堿基（正向是A 堿基），表明是c.519 C＞T 雜合突變；在X 染色體153 760 484 bp 位置處檢測(cè)到60 條reads 支持G 堿基（正向是C 堿基）和68 條reads 支持T 堿基（正向是A 堿基），表明是c.1 376 G＞T 雜合突變。

圖3 CNGB030108 樣本測(cè)序結(jié)果Figure3 The sequencing results of CNGB030108

3 討論

永生化指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有無(wú)限增殖能力的過程。目前應(yīng)用最多的方式是使用EB 病毒（EBV）轉(zhuǎn)化人外周血淋巴細(xì)胞從而獲得的一種能夠連續(xù)分裂、永久生存的B 淋巴細(xì)胞株，每株細(xì)胞含有正常的二倍體組型并且含有供者完整的遺傳信息。在B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中加入環(huán)孢霉素A，可以抑制T 淋巴細(xì)胞的免疫殺傷活性，有效阻止T 淋巴細(xì)胞對(duì)已轉(zhuǎn)化的B 淋巴細(xì)胞的攻擊，從而提高轉(zhuǎn)化效率。獲得的永生化細(xì)胞系在連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中染色體穩(wěn)定，可獲取足量的細(xì)胞遺傳資源用于研究。世界上基因細(xì)胞遺傳資源存儲(chǔ)機(jī)構(gòu)包括英國(guó)生物樣本庫(kù)（UK Biobank）、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）、美國(guó)國(guó)家人類基因細(xì)胞庫(kù)（The NIGMS Human Genetic Cell Repository），均將其作為最主要的技術(shù)法方法保存細(xì)胞遺傳資源［8-9］。

表2 永生化淋巴細(xì)胞系樣本驗(yàn)證結(jié)果Table2 The verification results of immortalized lymphocyte cell lines

我國(guó)常見的致病性G6PD基因變異類型包括c.95A＞G、c.392G＞T、c.487G＞A、c.493A＞G、c.592C＞T、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A，這9 種變異占總變異的90%以上［10］。本研究采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶突變類型的外周全血樣本，經(jīng)過EB 病毒誘導(dǎo)分化，最終成功建立了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的永生化淋巴細(xì)胞系，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因c.392G＞T 純合和雜合突變、c.871G＞A 純合和雜合突變、c.95A＞G 純合和雜合突變、c.1388G＞A 純合和雜合突變、c.1376G＞T純合和雜合突變、c.1360C＞T 雜合突變、c.1024C＞T純合和雜合突變、c.519 C＞T 雜合突變，涵蓋了我國(guó)常見的突變類型。同時(shí)對(duì)建系成功的永生化淋巴細(xì)胞株進(jìn)行高通量測(cè)序方法的驗(yàn)證，結(jié)果表明葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的永生化淋巴細(xì)胞系基因組DNA 的結(jié)果與臨床樣本的標(biāo)示結(jié)果一致。該永生化淋巴細(xì)胞系的遺傳信息穩(wěn)定，可作為國(guó)家參考品的遺傳資源，用于評(píng)價(jià)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量。