兩種滅活方法對(duì)2019新型冠狀病毒咽拭子標(biāo)本病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的影響

姜蕾 張麗媛 劉大寧★

2019 新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）是一種單鏈RNA 冠狀病毒，基因組序列由29 903 bp 構(gòu)成，該基因組擁有10 個(gè)基因，可以有效地編碼10 個(gè)蛋白。2019-nCoV 可引起呼吸道感染，目前WHO 已確定其感染所致肺炎統(tǒng)一命名為“新型冠狀病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）”。目前，新型冠狀病毒肺炎并沒有特定的治療方法，早期診斷與早期隔離是防止疫情擴(kuò)散的關(guān)鍵，因此，及時(shí)篩查出確診病人是疫情控制的首要任務(wù)［1-2］。在最新版本（新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案）的診療方案中，新型冠狀病毒核酸的檢出是確診依據(jù)，熒光定量PCR 技術(shù)為新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的主要方法［3］。新型冠狀病毒具有較強(qiáng)的傳染性，在進(jìn)行核酸檢測(cè)過程中，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)人員具有較大的感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究比較兩種不同咽拭子標(biāo)本滅活方法對(duì)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，為防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)感染和傳播，保護(hù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的安全提供有效的安全方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年2月1日以來濮陽(yáng)地區(qū)確診病例3例，依據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》，符合相關(guān)流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)，以及咽拭子檢測(cè)2019-nCoV 核酸陽(yáng)性。

1.2 試劑和儀器

病毒RNA 提取試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供、熒光定量RT-PCR 試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司（試劑A）和上海之江生物科技股份有限公司提供（試劑B）。RNA 樣本保存液由廣州邦德盛生物科技有限公司提供。熒光定量PCR 儀為ABI7500（Life Technologies，NY，USA）。

1.3 標(biāo)本采集與處理

被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(rùn)，被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3 次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3 次，將拭子頭浸入含2～3 mL 病毒保存液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

每份標(biāo)本分為三組，每組提取140 μL，分別采用三種處理方法，未滅活加入280 μL 生理鹽水，56℃滅活30 min 后加入280 μL 生理鹽水和加入280 μL 胍鹽RNA 保存液滅活。

1.4 核酸提取

中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的核糖核酸（RNA）抽提試劑盒，在生物安全柜內(nèi)對(duì)咽拭子樣本進(jìn)行核酸提取，嚴(yán)格安裝說明書上的操作步驟提取病毒提取液。

1.5 上機(jī)檢測(cè)

使用兩種不同的核酸檢測(cè)試劑對(duì)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Spearman 相關(guān)系數(shù)對(duì)不同處理的標(biāo)本CT 值進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Bland-Altman 圖對(duì)CT 值一致性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3 組qPCR 結(jié)果相關(guān)性分析

用試劑A 檢測(cè)，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值相關(guān)性分析，Spearman 相關(guān)系數(shù)為r=0.9959（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.9958（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.9966（P＜0.001），見圖1。用試劑B 檢測(cè)，未滅活組與56℃滅活30 min 組CT 值相關(guān)性分析，Spearman 相關(guān)系數(shù)為r=0.9886（P＜0.001）；未滅活組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.9967（P＜0.001）；56℃滅活30 min 組與胍鹽RNA保存液滅活組CT 值相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.9915（P＜0.001），見圖2。用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑同時(shí)檢測(cè)，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果相關(guān)性明顯。

2.2 3 組qPCR 結(jié)果一致性分析

用試劑A 檢測(cè)，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.3055（圖3a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.2335（圖3b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.2640（圖3c）。用試劑B 檢測(cè)，未滅活組與56℃滅活30 min組CT 值差異性分析，偏差=0.1643（圖4a）；未滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組CT 值差異性分析，偏差=0.06325（圖4b）；56℃滅活30 min 組與胍鹽保存液滅活組CT 組差異性分析，偏差=0.1472（圖4c）。Bland-Altman 分析結(jié)果顯示，用試劑A 與試劑B 兩種不同的試劑盒同時(shí)檢測(cè)，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果具有較好的一致性。

圖1 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果相關(guān)性分析（試劑A）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit A）

圖2 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果相關(guān)性分析（試劑B）Figure1 Correlation analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivation group（detection kit B）

圖3 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果一致性分析（試劑A）Figure3 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit A）

圖4 未滅活組，56℃30 min 加熱滅活組與胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果一致性分析（試劑B）Figure4 Consistency analysis of qPCR results among the un-inactivated group，the inactivated group heated at 56℃for 30 minutes and the guanidine inactivated group（detection kit B）

2.3 不同檢測(cè)試劑對(duì)同一種標(biāo)本處理方法下檢測(cè)結(jié)果一致性分析

試劑A 與試劑B 檢測(cè)結(jié)果CT 值差異性分析，偏差=1.031（圖5）。Bland-Altman 分析結(jié)果顯示，兩種試劑盒檢測(cè)同一標(biāo)本，qPCR 結(jié)果具有良好的一致性。

圖5 兩種檢測(cè)試劑對(duì)同一標(biāo)本處理方法下檢測(cè)qPCR結(jié)果一致性分析Figure5 Consistency analysis of qPCR results between the two test reagents treated the same specimen

3 討論

新型冠狀病毒屬于β 屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或者橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。其基因特征與SARA-CoV 和MERS-CoV有明顯區(qū)別。目前研究顯示與蝙蝠SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達(dá)85%以上。對(duì)冠狀病毒理化特征的認(rèn)識(shí)多來自對(duì)SARA-CoV 和MERS-CoV 的研究。病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯已定不能有效滅活病毒。經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑［4］。在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能。檢驗(yàn)人員在做好生物安全防護(hù)外，在不影響結(jié)果的前提下，若能在檢測(cè)前將標(biāo)本進(jìn)行滅活處理，將大大降低感染的幾率［5］。本研究通過2019新型冠狀病毒樣本核酸提取前，用兩種不同滅活方法分別處理咽拭子標(biāo)本，對(duì)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究選用兩種滅活方法處理咽拭子標(biāo)本，56℃30 min 加熱滅活和胍鹽病毒保存液滅活。胍鹽可使蛋白質(zhì)變性，溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。胍鹽可對(duì)新型冠狀病毒2019-nCoV 臨床樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)變性而起到滅活作用，大大降低了檢驗(yàn)過程中的生物傳染風(fēng)險(xiǎn)。胍鹽不僅具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，還具有抑制核酸酶的作用，從而保證釋放出來的核酸不被降解。

本研究用兩種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)，Spearman 相關(guān)系數(shù)對(duì)不同處理的標(biāo)本CT值進(jìn)行相關(guān)性分析后得出，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果相關(guān)性明顯。Bland-Altman 分析結(jié)果顯示，未滅活組、56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活組qPCR 結(jié)果具有良好的一致性。

綜上所述，56℃滅活30 min 組和加入胍鹽RNA 保存液滅活對(duì)于檢測(cè)2019-nCoV 核酸結(jié)果無影響，可在檢測(cè)前滅活以降低檢驗(yàn)人員感染風(fēng)險(xiǎn)。在后續(xù)的研究中，需加大標(biāo)本量，將有助于進(jìn)一步明確不同滅活處理對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響。